发布时间：2023-09-27 10:03:46
绪论：一篇引人入胜的酒驾的法律知识，需要建立在充分的资料搜集和文献研究之上。搜杂志网为您汇编了三篇范文，供您参考和学习。
当代革命军人核心价值观的实现需要内外两种力量的支持，内在力量来自于主体自身，外在的力量则来自于制度性的规范。由此可见，当代革命军人核心价值观的实现有内在路径和外在路径。在外在路径中，法律规范因具有普遍约束力，为价值观主体提供了具体的行为规则，是一种比较有效的价值观实现方式。道德和法律作为社会调控的两种手段，相互之间在必要的时候可以进行转化。当道德不足以发挥调控作用的时候，需要将相关的道德规范向法律规范进行转化；当社会成员能够做到自觉遵守法律规范，外在的强制性变得不再需要时，法律规范可以向道德规范进行转化。因此，当代革命军人核心价值观的法律路径即为当代军人核心价值观的法律化。
一、当代革命军人核心价值观法律化的必要性
道德和法律是两种社会调控的手段，各有其优势。不同社会历史时期，两者的地位会有所不同。当前，从整体上而言，道德在全球化进程中作为社会调控手段的地位逐渐减弱，而法律则日趋强化。美国现代法理学家博登海默曾说过：“那些被认为是社会交往的基本而必要的道德正当原则，在所有人的社会中都被赋予了强大力量的强制性质。这些道德原则的约束力的增强，当时是通过将它们转化为法律规则而实现的。”
道德法律化有其必要性，当代革命军人核心价值观法律化的必要性体现在以下三个方面：
1.普遍性约束的要求。道德和法律在适用主体的范围上存在较大差异。道德支配人们的内心生活和动机，法律调整人们的外部关系。道德关注的是个体的内在体验，仅适用于个体；而法律关注社会共同体的生活，适用于社会的全体成员。适用对象的普遍性是法律的基本特征。当代革命军人核心价值观并非只是一个事关个人道德修养的价值观，而是需要全体革命军人遵守的共同道德，它关系到军队这一集体能否形成共同的道德准则，进而转化为坚强的战斗力。因此，当代革命军人核心价值观自产生之日起就存在着普遍适用于所有军人的要求。道德的内在局限性阻碍了道德实现普遍性约束，而法律恰恰可以弥补这一缺憾。
2.外在规范性的要求。使道德规范得以实现的并不是外部的物理性强制与威胁，而是人们对道德规范所固有的正当性的内在信念。人们对于道德的服从是一种自觉服从，从内心产生服从道德义务的愿望和动力。道德对于严重危害他人和社会利益的行为，只能谴责而不能制裁。人们对于法律的服从是一种被动服从，是由于惧怕受到法律的惩戒而形成的服从心理。法律要求人们绝对服从它的规则与命令，而不论特定的个人是否赞成这些规则和命令；法律重视威胁适用物理性的强制手段。
当代革命军人核心价值观仅靠道德规范自身的内在约束力是远远不够的。它还需要来自外部的力量，并且有一定的强制力作为支撑。军人核心价值观的实践活动不能随心所欲，必须做到有章可循、有法可依。“凡是法律、法规禁止的就是不允许的”。法律对于违反规则的行为不着眼于帮教,而是着眼于处置。如此可以让军人由于惧怕惩戒而转变思想和态度。
3.加强道德建设的要求。全球化背景下人们的价值生活多样化、价值观念多元化趋势日益明显。经济转型期的利益冲突使一些传统的受道德调控的领域出现了新问题，已有的道德规范无法奏效，而短期内新的道德规范无法确立，社会短时期内在某些领域某些成员身上出现了道德真空。社会普遍的道德水平和军队所需要的道德水平存在较大差距。如何将官兵的多元化价值观引导至同一个方向，培养官兵具备较高的道德水平是一个全新的课题。当代革命军人核心价值观正是为了引领社会道德而提出的一种共同道德要求。它虽然是针对军人的道德要求，高于社会的普遍道德要求，但对社会成员而言有示范意义和标杆作用。
二、当代革命军人核心价值观法律化的操作方法
当代革命军人核心价值观法律化的过程就是用法律规范对价值观进行规范和激励的过程。价值观的规范和激励是两个方面，它分别体现为两种不同类型的法律规则。因此，道德规范的法律化必须包括两个方面：首先将道德规范转化为义务性规则，实现法律对价值观的有效规范；其次，制定相应的授权性规则，实现法律对价值观的有效激励。这既使法律规范体系达到权利义务的统一，也能有效促进价值观的实现。
（一）义务性法律规则构成价值观的规范机制
道德规范是一种典型的义务性规范。当代军人核心价值观的表述如果将句式补充完整将是“要（必须、应该、应当......）忠诚于党、热爱人民、报效国家、献身使命、崇尚荣誉”，这是义务性规则的表达句式。道德规范法律化的最直接结果是义务性法律规范,且在道德法律化过程中一般都要将道德进行降格化和具体化的立法技术处理，否则它就会脱离实际而无法产生相应的法律效用。例如“忠诚于党”如果转化为义务性规则将是按照不做损害党的利益的行为的标准设定一系列法律义务，如果违反这些义务将得到法律的否定评价。
目前我国已经制定了针对军人的相当数量的义务性法律规范。典型的如《刑法》，刑法中设有专门一章规定了“军人违反职责罪”，用惩戒性的法律规则对军人的行为进行规范和制约。又如《兵役法》所规定的现役军人的各项义务。《内务条令》、《队列条令》、《纪律条令》等同样是义务性规则，并且规定了违反相关法律义务时的罚则。但现有的义务性规则主要用于规范军人的一般行为，对于价值观所要求的行为的规范作用并不明显。在军人的一般行为规范和核心价值观所要求的行为规范中间还存在差距，需要用合适的义务性规则进行弥补。外军非常重视法律对价值观的规范作用。美军先后颁布了《品格指导纲要》、《品格指导手册》、《行动指南》、《行为准则》等条令条例，对军人价值观的内容、塑造方式、运行机制都进行了明确规定。此举值得我军借鉴。
（二）授权性法律规则构成价值观的激励机制
授权性规则和义务性规则的统一是法律规范的重要特征。在法律中，没有无义务的权利，没有无权利的义务。权利和义务互为保障，权利和义务的一致性有利于形成主体对法律的信任，从而愿意遵守规范。如果只享受权利无需履行义务，主体将产生特权心理，丧失对社会、对他人的责任感；只履行义务不享受权利，主体将或者没有履行义务的客观条件，或者主观上怠于履行义务。
一、引言
金融衍生品市场的不断创新推动了世界经济的增长，其中期货市场扮演着极其重要的角色。通过对期货价格与现货价格之间动态关系的研究，可以从一个侧面揭示出期货市场的运行效率，因为如果期货市场的运行是有效的，具有良好的价格发现功能，则期货市场与现货市场对新的市场信息的反应将较为接近，期货价格与现货价格之间必然存在紧密的联系，这时，期货价格与现货价格运动的方向应该一致，并且，价格变动的幅度也应该比较接近，即期货价格与现货价格之间存在长期均衡关系。否则，投资者就可以利用期货价格与现货价格之间的价格差异进行套利，从而使期货价格与现货价格之间回复到正常的状态。因此，对期货价格与现货价格动态关系的研究是期货市场研究中基础性的工作，对了解期货市场的运行效率具有重要意义。
二、文献综述
由于期货价格和现货价格之间的相互关系直接说明了期货市场的运行效率，因此，国外学者对期货市场的价格发现功能进行了广泛的研究，比较有代表性的包括：
Garbade和Silber（1983）最早通过考察前一期基差的变动对后一期期货价格和现货价格变动的影响建立了期货价格与现货价格之间相互联系的动态模型，来刻划期货价格和现货价格在价格发现功能中作用的大小。Engle和Granger（1987）以及Johansen（1988）以及Johansen和Juselius（1990）提出的协整分析为研究非平衡经济变量均衡关系提供了全新的方法，该方法在期货价格与现货价格动态关系的研究中得到了广泛应用。
我国期货市场发展已走过十多年的历程，目前对我国期货市场价格发现功能、运行效率、期货价格与现货价格动态关系等方面的研究主要包括：熊熊和王芳（2008）、葛勇和叶德磊（2008）发现现货市场在价格发现过程中起主导作用。华仁海和仲伟俊（2002）借助Garbade和Silber（1983）提出的方法对我国期货市场的价格发现功能进行了初步探讨。
三、研究方法
本文首先借助ADF检验期货价格的自然对数序列与现货价格的自然对数序列的平稳性，如果期货价格的自然对数序列与现货价格的自然对数序列同阶平稳则在此基础上建立VAR模型。其次，我们借助协整检验检验期货价格的自然对数序列与现货价格的自然对数序列之间是否存在协整关系，在此基础上再进行进一步研究。如果期货价格与现货价格之间存在协整关系，则可以利用误差修正模型（ECM）研究期货价格与现货价格之间的相互引导关系。期货价格与现货价格之间的误差修正模型可表示为：
四、实证研究
1.相关性分析
从相关数据可知，金属铝的期货价格与现货价格的走势十分接近，呈现出高度的相关性。利用Eviews软件计算可知，两者的相关系数为0.986，表明沪铝期货结算价与现货价格序列呈高度的正相关关系，价格的联动性很强。
2.ADF检验
ADF检验是由Dickey和Fuller（1976）提出的用于检验时间序列平稳性的一种统计检验方法.
由分析可知，期货价格的ADF值与现货价格得ADF值在5%的显著性水平下都大于临界值，接受原假设，可见期货价格与现货价格序列都是非平稳的，所以要对他们的一阶差分进行单位根检验。由表可知，期货价格一阶差分的ADF值与现货价格一阶差分的ADF值在5%的显著性水平下都明显小于临界值，拒绝原假设，所以期货价格一阶差分与现货价格一阶差分序列是平稳序列。
3.协整检验
由上节分析可知，期货价格与现货价格序列是非平稳的，而期货价格一阶差分与现货价格一阶差分序列是平稳序列，由此判定期货价格与现货价格为一阶单整序列，满足协整检验的前提。
由协整检验得残差序列E为平稳序列，进而得到期货价格与现货价格具有协整关系。
4.格兰杰因果检验
虽然回归分析考虑了一个变量对另一个变量的依赖关系，但这不一定意味着因果关系，换言之，变量间某种关系的存在不能够证明是因果关系或者影响的方向。格兰杰因果关系检验要检验的就是这类的因果关系是否存在，所以期货价格与现货价格之间的引导关系可以通过Granger因果检验来进行。
由检验可知，原假设现货价格不是期货价格的格兰杰原因被接受，即现货价格的变动不能引起期货价格的变动。原假设期货价格不是现货价格的格兰杰原因被拒绝，即期货价格的变动可以引起现货价格的变动。
5.误差修正模型（ECM）
协整分析中最重要的结果可能是所谓的“格兰杰表述定理”。按照此定理，如果两变量X和Y是协整的，则它们之间存在长期均衡关系。当然，在短期内，这些变量间的关系可以是不均衡的。两变量间这种短期不均衡关系的动态结构可以由误差修正模型来表述。
由分析结果可知，期货价格的短期变动对现货价格存在正向影响，此外，由于短期调整是显著的，表明现货价格与其长期均衡值的偏差中的约27%被修正。
6.脉冲响应函数
脉冲响应函数描述了一个内生变量对误差冲击的反应，具体来说就是当随机误差项发生变化，或者说模型受到某种冲击时，对内生变量的当期值和未来值所带来的影响。
由脉冲响应分析得到现期货市场的冲击对期货市场的影响主要体现在前5天，使期货市场的价格产生了剧烈的波动，在随后的交易日里趋于平稳并缓慢回归到原来的价格水平。由期现货市场的冲击对现货市场的影响在前15个交易日作用明显，在随后的交易日里才缓慢趋于平稳。由于现货价格变动对期货价格变动冲击的影响时间长度比期货价格对现货价格冲击的影响时间长度要短，因此，从冲击反应分析同样可以看出，相对于现货价格的影响力，铝的期货价格的影响力相对较大。
五、结论
本文利用协整检验、误差修正模型以及脉冲响应函数等从多个不同的角度对上海铝期货价格与现货价格之间的联系进行了实证研究，研究结果显示：铜期货价格与现货价格之间存在长期均衡关系，期货价格与现货价格存在单向因果关系，即期货市场在价格发现功能中处于主导地位，其中，在铝的价格发现功能中，期货市场占90%，现货市场占10%。以上研究结论表明，尽管我国期货市场早期过度投机盛行，期货市场秩序混乱，但经过较长时间的规范整顿，近几年我国期货市场运行的市场环境已明显好转，运行效率显著提高，期货市场价格发现和套期保值的功能逐步显现，这也为我国期货市场的进一步发展提供了良好的市场基础。
参考文献
[1]严敏，巴曙松，吴博.我国股指期货市场的价格发现与波动溢出效应[J].系统工程，2009，27（10）：32-38.
[2]徐信忠，杨云红，朱彤.上海期货交易所铜期货价格发现功能研究[J].财经问题研究，2005，10.
Autophagy activity of thyroid follicular cells is involved in animal experiments on the
pathogenesis of hashimoto's thyroiditis
MA Ding MA Chang-jun LU Fu-kun
Department of Endocrinology Bazhong Central Hospital
Abstract：Objective To investigate the autophagy activity of thyroid follicular cells involved in the pathogenesis of hashimoto's thyroiditis( HT) in animal experiments. Methods Thirty NOD. H-2 h4 mice were divided into control group and HT group according the random number table method,15 mice in each group. The occurrence of thyroiditis in mice was observed by histopathology. The mRNA expression of pro-inflammatory factors IL-23,IL-1β and interferon-gamma( IFN-γ) in the two groups of mice was analyzed by real-time polymerase chain reaction.The protein expression of mouse LC3-II,Beclin and apoptosis-related factors was analyzed by Western blotting. The accumulation of ROS in mice was detected by immunofluorescence and flow cytometry. Analyze the expression of AKT/m TOR/NF-κB signaling pathway proteins by immunohistochemistry. Results The degree of infiltration of monocytes in the thyroid tissue of mice in the HT group was( 1. 75 ± 0. 25) points,which was higher than that in the control group [( 0. 67 ± 0. 12) points],and the difference was statistically significant( P < 0. 05). The mRNA expression levels of IL-23,IL-1β and IFN-γ in the thyroid tissue of mice in the HT group were 2. 37 ± 0. 42,3. 04 ± 0. 71,2. 85 ± 0. 35,which were higher than those in the control group( 1. 26 ± 0. 14,1. 15 ± 0. 16,1. 09 ± 0. 12),the differences were statistically significant( P <0. 05). The protein expression levels of LC3-Ⅱ and Beclin in the thyroid tissue of mice in the HT group were 1. 25 ± 0. 18 and 1. 17 ± 0. 15,respectively,which were lower than those of the control group( 2. 07 ± 0. 34,2. 59 ± 0. 46),and the differences were statistically significant( P <0. 05). The protein expression levels of Caspase-3,Caspase-9 and Bax in the thyroid tissue of mice in the HT group were 2. 16 ± 0. 34,2. 74± 0. 46,2. 51 ± 0. 38,respectively,which were higher than those in the control group( 1. 18 ± 0. 15,1. 32 ± 0. 17,1. 08 ± 0. 09),the Bcl-2 protein expression level( 1. 07 ± 0. 12) was lower than that in the control group( 2. 14 ± 0. 32),the difference was statistically significant( P <0. 05). The percentage of positive cells in the thyroid follicular cells in the HT group and the immunofluorescence intensity values were( 62. 79 ±10. 47) % and 43. 18 ± 7. 26,respectively,which were higher than those in the control group [( 12. 56 ± 3. 15) %,16. 72 ± 3. 58],the difference were statistically significant( P < 0. 05). The protein expression levels of AKT,m TOR and NF-κB in the thyroid tissue of mice in the HT group were 2. 34 ± 0. 41,2. 15 ± 0. 38,2. 09 ± 0. 21,respectively,which were higher than those in the control group( 1. 15 ± 0. 10,1. 23 ±0. 14,1. 08 ± 0. 12),the differences were statistically significant( P < 0. 05). Conclusion In the pathogenesis of HT,the inflammatory cytokines IL-23,IL-1β and IFN-γ induce autophagy activation of thyroid follicular cells through the AKT/m TOR/NF-κB signaling pathway.This leads to accumulation of ROS in thyroid follicular cells and deterioration of HT pathology.
Keyword：Mice; Hashimoto's thyroiditis; Thyroid follicular cells; Autophagy; Reactive oxygen species; Inflammation;
桥本甲状腺炎(hashimoto's thyroiditis,HT)是最常见的器官特异性自身免疫性疾病，是由甲状腺免疫耐受能力下降引起的[1]。它的特点是淋巴细胞弥漫性浸润甲状腺，破坏甲状腺结构和产生自身抗体[2]。自噬是高度保守的生理过程，细胞内成分会经历溶酶体介导的自我消化和循环再利用，受损或老化的生物大分子和细胞器将从细胞质中移出[3]。在静止的细胞中，自噬发生在基础水平上，以消除内质网应激引起的缺陷细胞器，错误折叠的蛋白质和过量的蛋白质积聚。此外，自噬也是过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要清除机制，目的是防止细胞受损和死亡[4]。因此，自噬是正常细胞的生长、发育、功能和存活所必需的。在正常生理条件下，ROS对于甲状腺激素合成至关重要[5]。然而，异常高的氧化应激水平会导致对甲状腺滤泡细胞的损害，甲状腺的炎症，并最终促进HT的发展[6]。有证据表明，由于女性甲状腺中较高的氧化应激水平，女性甲状腺疾病的患病率较高[7]。HT与严重的神经炎症有关。胶质细胞，包括小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞，是神经炎症的主要细胞调节因子[8]。正常情况下，神经胶质细胞处于静止状态，但是在病理条件下，它们变得过度活化并释放出大量的神经毒性物质，例如促炎性细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-6[9]。已经发现自噬缺陷通过调节疾病状况的许多关键方面而赋予了几种自身免疫和炎性疾病的敏感性[10]。但是，HT的自噬机制仍然难以捉摸。在HT发病机制中，尚未完全了解诱导过量ROS积累的机制。本研究旨在探究甲状腺滤泡细胞的自噬活性参与HT的发病的动物实验。
1 材料与方法
1.1 实验动物
30只5周龄NOD.H-2h4小鼠购自四川大学(实验动物中心)[许可证号:SYXK(川) 2018-185]，体重约20 g，雌雄不限。在特定的无病原体条件下在大学动物实验室设施中繁殖和饲养小鼠。小鼠在标准实验室条件下(23±2)℃、光照12 h/黑暗12 h、湿度(55±5)%。5只小鼠为一组进行饲养，可随意获得自来水和啮齿动物食物。所有动物研究程序均符合实验动物的护理和使用指南。
1.2 试剂与仪器
完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA)、不完全的弗氏佐剂(incomplete Freund's adjuvant,IFA)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)由美国Sigma-Aldrich公司提供;胶原酶Ⅳ由美国Sigma公司提供，货号C1889;TRI试剂由加利福尼亚州卡尔斯巴德市的Invitrogen公司提供;AMV由美国威斯康星州的Promega公司提供;全细胞提取试剂盒、聚乙烯基二氟乙烯膜(polyvinyl difluoroethylene film,PVDF)由美国Merck Millipore公司提供;二喹啉酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白浓缩试剂盒、2,7-二氯氢荧光素二乙酸盐(2,7-Dichlorohydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)由上海碧云天生物技术有限公司提供;Pierce ECL-plus底物由美国Thermo Fisher科学公司提供;lightcycler480仪器由德国Roche公司提供;抗生蛋白链菌素过氧化物脂结合的二抗由北京博奥森斯科贸有限公司提供;Alpha View软件由美国AIC公司提供;流式细胞仪由美国BD Biosciences公司提供，型号BD FACS Calibur;荧光显微镜由日本奥林巴斯公司提供。
1.3 实验分组与HT模型建立
将所有小鼠按照随机数字表法分为对照组和HT组，每组各15只。所有小鼠适应1周后，HT组小鼠接受25μg在CFA中乳化的猪Tg乳化，皮下注射到尾巴底部，14 d后用IFA加强注射等剂量的Tg。对照组:小鼠用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution,PBS)代替Tg处理。尾静脉取血，酶联免疫吸附试验检测其血清TPOAb水平，TPOAb水平>60 IU/m L为模型建立成功。
1.4 方法
1.4.1 样品收集
建模后的最后1 d，将小鼠深度麻醉并在早晨(上午9︰00～11︰30)脱臼处死。立即收集血液、甲状腺。将血液样品离心以测量血清学参数，收集甲状腺用于组织病理学。
1.4.2 甲状腺滤泡细胞收集与培养
获取小鼠甲状腺组织。将新鲜的甲状腺组织用剪刀切成约1 mm3的小块，并与胶原酶IV(1.25 mg/m L)在Hank's溶液中于37℃孵育4 h。通过70μm的尼龙细胞过滤器过滤细胞悬浮液。将滤液以1 000×g离心5 min。将细胞重悬于含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI-1640中。然后，将甲状腺细胞铺在6孔板中(每孔1×106细胞)。24 h后，除去不含黏附细胞的上清液。将甲状腺滤泡细胞在RPMI-1640、10%FBS和Pen/Strep中于5%CO2中于37℃培养。
1.4.3 苏木精和曙红染色
对于组织病理学，固定新鲜的甲状腺组织并进行苏木精和曙红处理。从每只动物的5个不连续冠状切片中检查甲状腺的组织病理学。甲状腺炎分类标准是根据甲状腺浸润的百分比确定的:0为无浸润;1分为1～2个卵泡周围的炎性细胞间质积聚;2分为1～2个炎症细胞灶达到卵泡大小;3分为10%～40%炎症细胞浸润;4分为大于40%的炎症细胞浸润。2名研究者对组织学评分进行评估并取平均值。
1.4.4 RNA纯化和实时聚合酶链式反应(real-timepolymerase chain reaction,RT-PCR)
根据制造商的指导原则，使用TRI试剂从甲状腺组织中提取总RNA，并用无RNase的DNase处理，用AMV进行逆转录。PCR在lightcycler 480仪器上进行，初始保持步骤(95℃，5min)，在95℃下15 s，在60℃下15 s的50个循环，以及在72℃下30 s。使用2-ΔΔCt方法分析甲状腺组织IL-23、IL-1β和干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)相对表达水平。
1.4.5 蛋白质印迹分析
使用全细胞提取试剂盒从甲状腺组织中提取总蛋白。使用BCA蛋白浓缩试剂盒确定总蛋白浓度。首先，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶对5 mg蛋白质进行电泳，通过电泳将其转移到PVDF上。在5%牛血清白蛋白中封闭1 h后，将膜与抗蛋白质或β-肌动蛋白的抗体(标准对照)孵育，与HRP偶联的二抗孵育。使用Pierce ECL-plus底物检测信号，并使用Fluor Chem FC3摄像头系统进行扫描。使用Alpha View软件分析图像，并以图形方式显示定量分析的结果。
1.4.6 ROS水平检测
使用荧光探针DCFH-DA(购自美国MCE公司)监测小鼠甲状腺组织滤泡细胞中ROS水平，这是一种过氧化氢的特异性探针。收集组织用胰蛋白酶处理后，洗涤，并在无FBS的RPMI-1640中重悬3遍。使用流式细胞仪立即检测和分析1×105个细胞的DCF荧光，其激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。通过流式细胞术分析甲状腺滤泡细胞内ROS水平，采用阳性细胞的百分比(%阳性细胞)和平均荧光强度表示。另外使用荧光显微镜评估了从Nthy-ori 3-1细胞产生的ROS的DCF荧光。
1.4.7 免疫组织化学分析
将甲状腺组织固定在4%中和的甲醛溶液中，包埋在石蜡中，切成4 mm的切片，安装在载玻片上。解离和补液后，通过将样品在10mmol/L柠檬酸盐缓冲液(p H 6.0)中煮沸10 min，用PBS洗涤载玻片来进行抗原修复。将切片用PBS中的2%牛血清白蛋白封闭30 min，在4℃下与兔抗人AKT、m TOR、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)抗体孵育过夜。用PBS洗涤3次后，将切片用相应的抗生蛋白链菌素过氧化物脂结合的二抗处理。将组织切片用3,30-二氨基联苯胺和苏木精复染色，并在光学显微镜下观察。图形显示了Image-Pro plus 6.0软件对所有样品进行的定量分析结果。
1.5 统计学处理
所有统计分析均使用Graph Pad Prism 5.0进行。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HT组织病理学检测
通过组织病理学苏木和曙红染色观察小鼠中HT的发生，HT小鼠的甲状腺炎浸润严重程度(1.75±0.25)分高于对照组(0.67±0.12)分，差异有统计学意义(t=15.084,P<0.001)。组织学检查显示，对照组小鼠的甲状腺滤泡完整，分布均匀，在甲状腺组织中几乎未见单核细胞浸润。相反，HT小鼠表现出甲状腺肿大，甲状腺滤泡无序和破坏，并且在甲状腺组织中或多或少地发现了单核细胞浸润。
2.2 IL-23、IL-1β和IFN-γmRNA表达
HT组小鼠甲状腺组织中促炎因子IL-23、IL-1β和IFN-γmRNA表达均较对照组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 2组小鼠IL-23、IL-1β和IFN-γmRNA表达水平比较
2.3 LC3-Ⅱ和Beclin蛋白表达
HT组小鼠甲状腺组织LC3-Ⅱ和Beclin蛋白表达均较对照组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2 2组小鼠LC3-Ⅱ和Beclin蛋白表达水平比较
2.4 凋亡蛋白表达
HT组小鼠甲状腺组织Caspase-3、Caspase-9、Bax的蛋白表达水平均较对照组显著升高，Bcl-2蛋白表达水平较对照组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。
表3 2组小鼠凋亡蛋白表达水平比较
2.5 ROS水平
HT组小鼠甲状腺滤泡细胞中ROS阳性细胞占比、免疫荧光强度值均较对照组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。
表4 2组小鼠ROS水平检测结果比较
2.6 AKT/m TOR/NF-κB信号通路的蛋白
HT组小鼠甲状腺组织中AKT/m TOR/NF-κB信号通路蛋白的表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。
表5 2组小鼠AKT/m TOR/NF-κB信号通路的蛋白表达水平比较
3 讨论
HT是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病，影响了大约5%的普通人群，尤其是女性，其特征是甲状腺内单核细胞浸润以及血清自身抗体的升高，这是甲状腺功能减退的主要原因[11,12]。但是，大多数患者(约79.3%)在诊断时表现出正常的甲状腺功能，并且可能多年甲状腺功能正常[13]。
自噬是在许多情况下导致程序性细胞死亡的关键途径[14]。这是细胞分裂自身成分的基本和稳态过程，从而避免了坏死引起的有害作用。一些研究人员揭示了自噬途径及其相关蛋白在免疫和炎症中的关键作用[15]。自噬过程平衡了免疫和炎症的有益和有害影响，并可以预防传染病，自身免疫和炎性疾病的发展[16]。本研究结果显示，HT小鼠的甲状腺滤泡细胞中检测到自噬相关蛋白(即LC3-Ⅱ和Beclin)活性降低，细胞凋亡水平升高。
凋亡在HT中起重要作用。在甲状腺组织的凋亡过程中，Bcl-2家族和促凋亡蛋白BH3相互作用域死亡激动剂(Bid)可以激活Caspase-8分子并启动内源性途径来激活凋亡以释放细胞色素C[17]。在d ATP存在下，细胞质与细胞凋亡相关因子1结合，并促进Caspase-9的结合，从而形成凋亡小体。激活的Caspase-9可以激活其他Caspase，例如Caspase-3并诱导凋亡[18]。内在途径(线粒体)的激活还可以直接破坏细胞的基本结构，例如DNA，并导致代谢错位或破坏细胞周期[19]。甲状腺组织的稳态对于甲状腺甲状腺细胞非常重要。本研究结果显示，HT小鼠的甲状腺滤泡细胞凋亡率增加，Caspase-3和Caspase-9表达升高;凋亡因子Bax的表达升高，抗凋亡因子Bcl-2的表达降低，Bcl-2/Bax的比例降低。
ROS是由活生物体的所有细胞产生的，能够在氧化还原相关的不同细胞功能调节中起作用，包括对应激物的反应，血管生成和细胞增殖。甲状腺激素生成过程中，在甲状腺中需要适量的ROS。但是，过量的ROS会导致甲状腺滤泡细胞的病理损伤和自身免疫性甲状腺疾病(例如HT和GD)的发展[20]。ROS的产生和氧化应激与各种生长因子和细胞因子的产生和激活相互关联。近年来的许多工作表明，与简单的开/关信号相比，ROS的产生与自噬的发生更为紧密和协调[21]。过量的ROS可通过细胞成分的氧化而引起细胞损伤，从而导致细胞损伤无法修复并诱导细胞凋亡。在正常生理条件下，基础自噬负责清除非功能性线粒体和蛋白质积累和其他细胞器的细胞质。细胞自噬缺陷导致去极化线粒体和蛋白质的积累，从而诱导炎性体激活剂(如ROS或线粒体DNA)的释放。自噬抑制作用允许促炎性细胞因子的加工和分泌，该过程可能取决于ROS的积累。ROS可以通过刺激ATG4的蛋白水解活性和其他机制来诱导自噬。此外，自噬已被证明可以通过减少线粒体ROS的产生来保护细胞免受DNA损伤[22]。研究表明，自噬可通过降低软骨细胞中的ROS水平来保护软骨细胞免于凋亡[23]。值得注意的是，自噬的抑制可能导致生物体能量不足，并促进触发凋亡的氧化反应。本研究初步研究表明，在在HT小鼠的甲状腺滤泡细胞中可以观察到ROS积累增加，说明ROS参与HT的炎症过程。
有报道表明，AKT/m TOR信号通路在自噬体形成的调控中起重要作用[24]。本研究证明，在HT发病机制中，炎性细胞因子IL-23、IL-1β和IFN-γ通过AKT/m TOR/NF-κB信号通路诱导甲状腺滤泡细胞自噬激活，这会导致甲状腺滤泡细胞中的ROS积累和HT病理恶化。因此，靶向炎症因子、自噬激活或m TOR可提供潜在的治疗策略，以防止甲状腺细胞受到细胞氧化损伤。
4 结论
总而言之，HT抑制了甲状腺滤泡细胞自噬活性和ROS在甲状腺滤泡细胞中的积累取决于AKT/m TOR/NF-κB信号通路的激活，靶向炎症因子、自噬激活或m TOR可提供潜在的治疗策略，以防止甲状腺细胞受到细胞氧化损伤。
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