发布时间：2024-01-16 16:23:45
绪论：一篇引人入胜的药理学的研究方法，需要建立在充分的资料搜集和文献研究之上。搜杂志网为您汇编了三篇范文，供您参考和学习。
中图分类号：G642.4 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）35-0087-03
以培养大学生创新精神和研究能力为目标的研究性教学已成为世界高等教育改革的趋势。然而，目前动物医学专业的大学生面对繁多的理论课程，多数是被动地应付，缺少主动学习意识。如何引导学生去主动学习并掌握专业知识和技能，毕业后能快速适应新形势和未来社会经济发展趋势的要求，是困扰教学的主要问题之一。围绕这个问题，有许多解决方法，其中研究性教学以学生为中心，辅以教师的指导，注重激发学生学习的主动性与积极性，既能发挥教师的主导作用，又能发挥学生的主体作用；既能培养学生的学习兴趣，又能培养学生分析问题和解决问题能力；既能使学生系统掌握本学科知识，又能培养学生的临床实践能力和创新精神[1]。因此，特别适于动物医学专业大学生的教学过程。本文以“兽医药理学”这样一门有代表性的专业基础课程为例，探讨研究性教学模式的实际应用，以期更好地提高教学质量。
一、建立研究性教学的理念
兽医药理学是动物医学专业一门重要的专业基础课，主要任务是培养学生在临床上合理用药、减少不良反应，具有教学内容多、教学时数少，理论性和实践性都很强的特点。教师上课“满堂灌”，学生下课背课本的传统教学模式，使学生处于一种被动的学习状态，学生不但无法深刻理解和掌握兽医药理学的基本原理和知识，而且不会灵活运用和创新，收不到理想的教学效果。开展研究性教学，有利于教会学生敏锐地发现问题、主动地提出问题、积极地寻求解决问题的方法，有利于培养学生的创新意识，锻炼和培养学生的创新能力，激发学生的学习积极性，提高学生解决实际问题的能力[2]。因此，开展研究性教学，首先要从三个方面建立研究性教学的理念。
1.教师应转变传统理念。在以往的教学模式中，教师是主体，对学生的关注较少。教师自己也习惯于认为自己应该知识渊博，所谓给学生一杯水，自己要有一桶水。但研究性教学是借助于问题或案例进行的一种开放性学习，不仅问题和案例对教师来说是新的，解决问题的方式、途径也不是唯一的，教师在这个过程中也成为一个学习者。因此，教师在开展研究性教学时，应转变自己的心态，深刻理解教师的主要作用不是回答学生提出的所有问题，而是注重培养学生解决问题的能力[3]。
2.教师应注重学生能力的培养。对于动物医学类课程，研究性教学的主要目的应是培养学生的能力，尤其是培养学生应用知识的能力。不同教师讲授同一门兽医药理学课程，即使采用相同的教材，其效果也不会完全相同。有些教师讲授的内容，学生考完试也就忘记得差不多了，到临床应用时仍然要去翻书，但有些教师讲授的内容，学生在临床上遇到相关的病例就会联想起来。根本原因在于授课教师的临床经验、对课程的研究程度、授课方法与理念的不同。教师在进行兽医药理学课程教学时应注重学生运用知识能力的培养，强调不要死记硬背课本上的内容，而要与实践相结合，引导学生应用所学理论知识解决实际问题。而研究性教学通过教师指导学生选择和确定与课程相关的专题或病例进行研究，使学生在主动探索、积极思考、大胆实践的研究和学习过程中，学习知识、应用知识、解决问题，从而提升学生的综合素质，培养学生的创造能力和创新精神[1]，因此，尤其适合运用于兽医药理学课程教学中。
3.学生改变学习心理与学习习惯。任何的教学过程都离不开学生的参与。与传统教学方式相比，研究性教学对学生的学习方法和学习心理提出了挑战。研究性教学的顺利进行，不仅需要教师的努力，更需要学生学习心理与学习习惯的改变。兽医药理学研究性教学过程从临床病例或相关的专题开始，学生的作业没有现成的标准答案，需要去进行调查研究，并查阅一定数量的专业文献。对于习惯于传统的填鸭式教学模式的学生来说，参与教学、积极思考、大胆存疑、完成没有标准答案的作业是他们面临的新的挑战，而且从被动听讲到主动参与对话，学生也需要跨越心理界限。所以，在开展研究性教学时，要让学生明白，课程学习本身不仅在于学习知识，还在于掌握学习并运用知识的能力，应学会分析问题的思路和解决问题的方法。这样才能让学生更充分了解自己在学习过程中的角色，激发学习热情，真正发挥研究性教学中学生的主体作用[3]。
二、在兽医药理学课程中开展研究性教学的探索
1.病例分析教学。病例分析是一种将兽医学理论知识和临床实践能力有机结合起来的有效方法，具有以案释法、教学相长、注重分析、培养能力的特点，可以让学生把课堂上学习的理论知识运用到临床病例中，培养兽医专业学生的思考能力、判断能力、实践能力及创新能力。病例的选择与组织是病例分析教学目标能否顺利实现的关键。我们尝试的病例分析教学方法分为四个阶段：
第一阶段：在本课程实际教学活动中可以要求每一位学生到动物医院寻找某一个或某一类典型病例，通过观察动物医院医生在这些病例诊疗过程中的药物使用情况，结合理论教学内容，仔细分析所用药物的种类、应用方法、原因、效果等。在此基础之上，通过各种途径查阅文献，了解目前针对该疾病的药物治疗原则、影响因素、存在问题及发展趋势，然后提出应用药物控制疾病的有效措施。根据以上资料，让每一位学生撰写完成一份某疾病治疗中的药物应用分析报告。
第二阶段：教师根据学生的分析报告，按不同病例将学生分成不同的研究小组，小组成员在一起分析、讨论后，将同类分析报告综合，进行进一步的完善、整理，最后研究小组共同或指定专人撰写病例分析报告。这样既充分发挥了各研究小组成员的积极性和主动性，又强调了各研究小组成员的分工合作。
第三阶段：汇报研究成果阶段，由各小组推荐汇报人，向全班汇报研究过程和研究结果，回答来自同学和教师的提问，并尽可能让研究小组成员都有发表自己见解和意见的机会，同时允许小组之外的学生提问并展开讨论。最后由教师对研究情况进行归纳总结。这个环节重在增强学生的语言表达能力与应变能力。教师引导学生对研究病例涉及的主要问题进行总结，对研究成果进行分析归纳，并可联系实际，对当前知识点进行深化与迁移。
第四阶段：考核评定阶段。由教师根据病例分析报告、汇报表现、答辩情况进行评分，各部分均制定相应的评分标准，最终对学生在本环节学习中的表现给出评价。
在这样的病例分析教学过程中，教师不但要引导学生去思考、去争辩，做出决策和选择，解决特定病例中药物选择使用的问题，进而从中获得某种经历和感悟，而且要引导学生探寻特定病例的复杂过程及其背后隐含的各种因素和发展变化的多种可能性[4]。使学生通过对这些病例用药的分析，把所学兽药知识与真实病例系统地联系起来，不仅激发了学生浓厚的学习、研究兴趣，还使学生认识到在疾病治疗过程中药物选择、应用的灵活性与多变性，并初步掌握一般疾病治疗的原则，为他们今后合理应用兽药解决实际问题奠定了基础。
2.专题研究教学。专题研究教学模式是以研究组织教学，将科学研究方法和研究能力的培养融合在课程教学过程中，培养学生从事课题研究的创新能力和创新思维[4]。
培养学生的动态思维，动态地学习并运用兽医理论知识分析、解决各种临床实际问题是兽医专业大学生应具备的重要素质，专题研究就是直接服务于这一素质培养的重要教学方法。通过提出课题、进行准备、开展研究、汇报评价等教学过程，可以收到很好的激发学生自主学习和积极参与的热情、提高学生语言表达能力等教学效果。
在专题研究教学中，教师提供的课题应当富有启发性，能引发学生深入思考。例如，我们在针对动物医学专业学生开展的专题研究教学中，设计了“我校动物医院中常用药物应用主要不良反应调查？实际应用中如何避免这些不良反应的发生”“结合前一时期发生的“速生鸡”事件，阐述我国现阶段是否应禁止在饲料中应用抗生素作为促生长添加剂？并分析利与弊”“分析兽医临床用药中联合用药的利与弊”“当前我国动物源性食品中兽药残留的种类、残留的原因？如何有效控制”等多个课题供学生选择。专题研究教学始终诱导和鼓励学生发现更复杂、更深层次的问题，而问题的解决是基于已学知识的综合运用[4]。
与病例分析教学相似，专题研究教学环节也分为四个阶段：
第一阶段：由学生从教师提供的若干个课题中选择自己最感兴趣的一个进行调查、分析、查阅并研究相关资料，撰写完成专题报告。
第二至第四阶段与病例分析教学相同，依然是教师根据选题的不同，将学生分成不同的研究小组，各组学生在各自研究报告基础上组织讨论，最后形成书面报告，并以口头报告的形式完成工作任务。在完成调查分析、组织讨论、讨论纪要写作、项目报告的写作与宣讲等过程中，学生亦能很好地锻炼组织能力和交流沟通能力。
三、研究性教学方法实施中的难点
1.问题的设计。无论是病例分析教学还是专题研究教学，研究的主题均应围绕本专业培养目标以及学生未来工作实践所需进行设计。它们必须难度适中，不能太难或太大，否则在规定时间内难以完成；也不能太小或不具备足够的挑战性，否则难以引起学生的兴趣。还要适当联系本专业领域的难点和社会热点问题，使学生能够学以致用[4]。
2.教师对教学过程的掌控。教师对研究性教学过程有效性的把握亦是教学的难点。教师在研究性教学过程中的指导作用影响着教学过程的质量与效率，尤其是在学生刚开始尝试运用这种新方式进行学习时，因缺乏经验与训练，不知道该怎么去做，这时候教师的指导作用就显得举足轻重。因此，教师要充分发挥引导、支持作用，而非主导作用，重点是让学生充分发挥学习的主动性与积极性。教师的主要任务应当是精心准备，布置好研究任务，明确学习和研究的基本要求，及时解决学生在研究过程中遇到的困难和提出的问题，并引导学生对研究内容涉及的主要问题进行回答与总结，对研究成果进行分析归纳，并联系实际，对当前知识点进行深化与迁移[5]。
3.教学的评价。由于没有标准答案，解决问题的答案完全有可能超出教师的原有知识积累，教师在评价方案上也要花费更多的时间。同时，由于课题最后是以小组为单位完成的，对每个组员的评价也是一个难题。因此，最后学习结束时如何评价学生工作的优劣，对教师提出了比传统教学方法更高的要求[4]。
4.不利于知识的系统性学习。病例分析教学或专题研究教学这类方式的学习是基于问题的解决，因此，所有的知识因围绕该问题，而使知识的学习缺乏系统性和完整性。对于理论性强的基础知识，如兽药的作用机理、体内过程等部分内容，并不适用于研究性教学。
5.教师的投入不足。由于研究性教学过程中，教师在进行课题筛选、报告审阅、分组指导、组织讨论、总结汇报时，要花费几倍于常规课程的时间。同时，大学教师还面临着教学与科研工作的冲突，目前的评价体系更关注教师的科研成果，再加上目前对这种教学方法工作量的计算、教学效果评价难等问题，导致教师对研究性教学的投入不足，最终可能敷衍了事、草草收场，不能真正实现研究性教学的目标。这些问题的存在对大学管理模式的革新亦提出了更高的要求。
参考文献：
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Effects of Shenmai San on Hemodynamics in Isolated Working Guinea Pigs Hearts by Serum Pharmacology
Abstract：ObjectiveTo observe the effects of Shenmai San on hemodynamics in isolated working guinea pigs hearts. MethodsThe experiment was accomplished by serum pharmacology. Different ig dosages(5，10 ml·kg-1) were administered to rabbits twice a day for three consecutive days .The blood was taken at 60 min after the last administration and the serum was separated. The separated serum was added to the isolated working guinea pigs hearts. The effects of Shenmai San on heart rate (HR)，arterial blood pressure (AP)，left ventricular systolic pressure (LVSP)，left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP)，and ±dp/ dtmax were observed. ResultsThe herbal Shenmai San serum slowed HR and reduced AP、LVEDP，increase LVSP and ±dp/ dtmax (P
Key words：Shengmai San ; Serum pharmacology ; Isolated working guinea pigs heart
生脉散又名生脉饮，是中医益气养阴的著名古方，由人参、麦冬、北五味子组成。方中人参补肺益气以生津，为主药;麦冬养阴、清热以生津为辅药;五味子固表止汗而生津，为佐使药。以人参、麦冬、五味子三药一补一清一敛，益气生津，敛阴止汗，使气阴复而脉气生，因而后世将其作为“益心复脉”的基础方。近年来的众多研究显示其药理作用相当广泛，尤其对心血管系统作用的研究报道颇多，如正性肌力、抗心律失常、改善顽固性心衰、双向调节血压以及降低心肌梗塞后的死亡率［1］等。但用血清药理学实验方法来研究生脉散对豚鼠离体工作心脏血流动力学的影响尚未见报道。本实验旨在用豚鼠离体工作心脏模型，观察生脉散对豚鼠离体工作心脏血流动力学的影响，以探讨生脉散的药理作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 豚鼠18只，雌雄不拘，体重300～350 g， 家兔，体重2.0～2.5 kg，家兔和豚鼠购于湖北省实验动物研究中心。
1.1.2 仪器美国BIOPAC公司MP150型16道生理信号记录分析仪及插件。恒温循环水浴泵(北京医疗设备厂)。
1.1.3 药品与试剂生脉注射液由江苏苏中药业股份有限公司生产（规格10 ml/支，每10 ml相当于红参、麦冬各1 g;批准文号：国药准字Z32021054;批号：20031203)，其余各试剂均为市售分析纯。
1.1.4 含药血清的制备家兔，体重2.0～2.5 kg，分成3组，每组5只。第1组为对照组，灌胃NS 10 ml·kg-1;第2组生脉注射液低剂量组（含药血清低剂量组），灌胃剂量为5 ml·kg-1，第3组生脉注射液高剂量组（含药血清高剂量组），灌胃剂量为10 ml·kg-1 。以上各组灌胃2次/d，连续3 d。家兔末次给药前12 h禁食，不禁水。末次给药后60 min从耳缘静脉取血，3 000 r·min-1离心20 min，分离含药血清， 50℃灭活30 min，于-40℃冷冻备用。
1.2 方法
1.2.1 制备豚鼠离体工作心脏［2］将豚鼠迅速脱臼处死，打开胸腔，取出心脏，经主动脉插管，用K-H缓冲液(NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2 2.5 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，NaHCO3 25 mmol/L，Glucose 11 mmol/L，95%O2+5%CO2，37℃，pH 7.4)先以Langendorff模式逆行灌注，然后于肺静脉行左房插管，以备顺灌。再向左室插管，用美国BIOPAC公司MP150型16道生理信号记录分析仪及插件记录左室收缩压(LVSP)、左室内压最大上升及下降速率(±dp/dtmax)、左室舒张期末压(LVEDP)，主动脉插管记录动脉血压(AP)，于心房和心室安置电极以记录心率(HR)变化。心脏搏动稳定后改以前负荷1.17 kPa，后负荷5.38 kPa恒定状态顺向灌流心脏，按给含药血清后3，5和10 min的顺序观察药物作用。
1.2.2 动物分组 3组， 每组9只动物， ① 对照组(A)：将家兔对照组采血分离的血清给予豚鼠的离体工作心脏（以下各组含药血清在灌流液中的体积分数为4%）连续灌流；② 含药血清低剂量组(B)：将家兔生脉注射液低剂量组采血分离的血清给予豚鼠的离体工作心脏连续灌流；③含药血清高剂量组(C)：将家兔生脉注射液高剂量组采血分离的血清给予豚鼠的离体工作心脏连续灌流。
1.2.3 统计学处理 实验数据以±s表示，采用给药前后配对t检验。
2 结果
在离体工作心脏搏动稳定后，按给含药血清后3，5和10 min的顺序观察含药血清作用。含药血清在给药后不同时间均可减慢HR，降低AP和LVEDP，增高LVSP和±dp/dtmax，与给药前比较差异有显著性(P
表1 含生脉散血清对豚鼠离体工作心脏血流动力学的影响（略）
与正常血清对照组比较，**P
3 讨论
心脏的泵血功能取决于心肌的收缩性能以及前、后负荷的综合效应，反映心脏收缩性能的参数LVSP和±dp/dtmax在一定程度上反映心室壁肌张力变化，从而反映心肌纤维收缩成分的收缩程度，但这些参数在在体情况下，容易受前、后负荷以及神经、体液的影响，因而很难正确评价药物对心肌收缩性能的影响［3］。传统的Langendorff离体心脏灌流法排除了神经体液的调控作用，但不能同时控制前、后负荷［4，5］。而本实验则为顺向灌流，在前负荷固定在1.17 kPa，后负荷固定在5.38 kPa的前提下，灌流液依靠离体心脏工作来维持循环，所以能够在排除了前负荷和后负荷影响的条件下观察离体心脏的泵血功能与心肌收缩性能的变化［6］。
LVSP和+dp/dtmax代表等容收缩期左心室内压力及最大变化速率，在一定程度上反映心室壁的肌张力变化，从而反映心肌纤维收缩成分的收缩速度［7］。生脉散可使LVSP和+dp/dtmax增高，表明其可提高心脏的收缩性，因而使心脏收缩更敏捷，心室腔残留血量减少，心室壁张力降低，从而降低维持心室壁张力所需的耗氧量。-dp/dtmax代表等容收缩期左心室最大舒张速度，同时也是心肌早期舒张功能改变的敏感指标［8］。生脉散可使-dp/dtmax增高，表明其可提高心脏的舒张功能，因而使回心血量增多，心输出量增加。
本实验结果表明， 生脉散含药血清对离体工作心脏血流动力学的影响表现为减慢HR，降低AP，LVEDP，增高LVSP和±dp/dtmax， 且具有剂量依赖关系， 表明含药血清的药理作用强度与动物的给药量呈显著的量效关系，提示生脉散具有正性肌力作用和负性频率作用， 结果与以前学者的研究相一致［9］。
另外，对生脉散正性肌力作用和负性频率作用的报道至今均为体外实验或静脉直接给药所得结论。对有效成分并不十分确切的这一粗制剂经口给药后能否产生同样的活性尚未见报道。本实验采用生脉散给动物口服，取其血清进行体外实验，这样可排除其所含杂质成分包括无机离子的干扰。实验结果表明，含生脉散血清与生脉散制剂直接给药两者对心肌的正性肌力作用基本相似。说明其正性肌力作用和负性频率作用的有效成分确能经胃肠道吸收入血。
观察复方中药对器官的影响方法较多，但若用复方中药直接接触器官，其复杂的成分可影响实验的结果。而给动物灌服中药一定时间后，取其血清进行实验的药理学方法就具有一定的优势，近年来许多中药药理实验即采用此方法［10］。任何新的方法学都需经过一定的时间，在探索的过程中得以建立，在研究过程中逐步加以完善，逐渐推广应用，血清药理学方法作为一种新的方法也不例外，必然存在局限性及某些问题。如:血清标本采集时间的确定、含药血清药物浓度的测定与选择、血清的处理、不能保证中药全部通过血液而起作用以及中药尤其是复方复杂的药物代谢动力学及血清化学等，以上存在的问题在今后的研究过程中还有待逐步加以解决，以更好地促进中药药理的研究。
鉴于生脉散的有效成分极其复杂，故对其确切作用机制仍不明确，尚有待进一步研究。
【参考文献】
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中图分类号：R285.5文献标识码：A
文章编号：1673-7717(2008)05-1108-02
Research Application of Blood Serum Pharmacology Method on Induction of Tumor Cell Apoptosisand Lowering of Enzyme Activity
CAI Shuo1，LIU Shan2，ZHANG Lihong1, Jin Chunfeng1, Liu Chunying1
（Liaoning University of TCM,Shenyang 110032,Liaoning China；2.Fourth People's Hospital of Shenyang,Shenyang 110032,Liaoning,China）
Abstract：Objective:To explore the application of blood serum pharmacology method in the research of inducing cell apoptosis and reducing the enzyme activity. Methods:Using Chinese native medicine serology method of treating the liver cancer, stomach cancer, lung cancer, big cancer of theintestines to discuss the effect of inducing tumor cell apoptosis, reducing the enzyme activity of ATP (Mg2+ - ATPase) and the glucose -6-phosphatase (G-6-Pase) of tumor cell. Results:①Four kind of different compound Chinese medicical blood serum all can induce the cell apoptosis of corresponding liver cancer cell lines ,A549 human lung cancer cell lines, CCL229 human colorectal carcinoma cell lines and cell line SGC7901. ②The activity of ATP and Glucose -6- phosphatase in tumor cell is decreased .Conclusion:The research application of blood serum pharmacology method on the induction of tumor cell apoptosis and the lowering of enzyme activity has the stability and the credibility.
Keywords:blood serum pharmacology;tumor;cell apoptosis;Mg2+-ATPase;glucose-6-phosphatase
20世纪80年代中期，日本学者Iwama H等率先提出“血清药理学方法”。此法是先给动物灌胃给中药，一定时间后再采集、分离其血清，并用此含药血清进行体外实验[1]。血清药理学方法已被广泛用于中医药作用机制的研究，研究层面已涉及到细胞增殖、分化、凋亡与细胞周期的调节以及基因表达等方面。本研究采用治疗胃癌、肝癌、肺癌、大肠癌等中药血清学方法，深入探讨其诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤细胞三磷酸腺苷酶（Mg2+―ATPase)与葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)酶活性作用。
1 实验方法
1.1细胞培养主要试剂 抗肝癌、胃癌、肺癌、大肠癌等不同中药复方中的中药，均由辽宁中医药大学第一附属医院提供。
1.2中药制剂制备 将3个不同中药复方组成后传统煎制：中药清水浸泡2h，煮沸后文火煎15min，纱布过滤取汁，药渣加水再煎20min，两次药汁混合，浓缩为100%。
1.3药物血清制备 动物：SD大鼠由辽宁中医药大学实验动物中心提供。30只SD大鼠随即分为3组，即中药组10只，化疗组10只，对照组10只。实验前禁食12h，采用2次给药方法（第1次给药2h后重复等量给药1次），每100g大鼠灌胃中药制剂1mL，2次/日连续灌胃3天。化疗组、对照组生理盐水等量灌胃3天。分别在末次给药后1、2、3h采血，戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下，下腔静脉取血，静置4h，4℃，3000r/min 20min离心，分离血清，同种条件药物血清混匀，过滤，56℃30min灭活，-20℃保存，备用。
血清分组：中药血清组（中药组）、化疗血清组（西药顺铂-DDP组）、对照血清组（对照组）。（1）中药血清组：临用前将中药组大鼠血清加入PRMI1640培养液，浓度分别为5%、10%、20%。（2）化疗血清组：用含10%化疗组大鼠血清PRMI1640培养液，DDP的终浓度为5%、10%、20%。（3）对照血清组：大鼠血清中加入PRMI1640培养液，终浓度为5%、10%、20%。
1.4细胞株 肝癌细胞株、SGC7901胃癌细胞株、细胞株 A549人肺癌细胞株和CCL229人大肠癌细胞株和均由中国医科大学生物教研室卫生部重点实验室提供。
2细胞培养
将细胞从冻存于液氮中的安瓶取出，放入37～40℃水浴中1min内融化，无菌条件下打开安瓶，接种于2只无菌培养瓶中。加入10%小牛血清PRMI1640培养液，在5%CO2，37℃条件下CO2培养箱中培养，倒置显微镜下动态观察细胞形态，24h后见细胞贴壁生长状态良好，弃培养液，分别加入各组血清，继续培养。
3标本制备
3.1细胞凋亡 生长在培养瓶内的贴壁细胞用2.5%戊二醛4℃原位固定2h，用橡皮铲刮下细胞，转至离心管内，低温高速离心机2000r/min，15min，琼脂处理成块，PBS冲洗，1%锷酸（OsO4）后固定1.5h，梯度乙醇、丙酮脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片机（LKB-V）切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜（JEM-1200）观察、摄片。
3.2酶细胞化学 取出培养皿中的载片，PBS冲洗，2%多聚甲醛固定30min，8%蔗糖脱水，3次×30min，分别加入Mg2+-ATP酶和G-6-P酶孵育液，37℃孵育45min，双蒸水冲洗，2min×3次，2%硫化铵成色，2min，双蒸水冲洗，2min×3次，梯度乙醇脱水各10min，甘油明胶封片，普通光镜下观察、拍片。
4 结果
4.1 细胞凋亡 ①正常对照组：各组肿瘤细胞株多为长梭形，表面可见较多的微绒毛，线粒体、粗面内质网、高尔基复合体、溶酶体等细胞器丰富、排列规则。②中药组：细胞表为椭圆形、圆形。表面微绒毛明显减少、消失。胞浆浓缩，可见大小不等的空泡，泡内容物电子密度与机制相似。细胞核变小、不规则，染色质浓缩、边集，呈断裂状，部分线粒体肿胀、空泡化。可见到典型的凋亡小体：圆形，可见从凋亡细胞脱落。位于凋亡细胞一侧，表面有完整的细胞膜包裹，小体内可见染色质碎片及破碎的内质网、囊泡化的线粒体等结构。③化疗组：结果与中药组相似，可见典型的凋亡小体。
4.2 酶细胞化学 ①Mg2+-ATP酶：光镜下可见对照组细胞Mg2+-ATP酶主要定位在细胞膜内侧，黑色酶反应颗粒大小均匀，密度大，呈线状规则排列，酶活性强。与正常组比较，中药组、西药组细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低。提示酶活性明显下降。②G-6-P酶：光镜下可见对照组细胞的G-6-P酶主要定位在细胞质内，酶反应颗粒粗大，排列密集，呈融合状，酶活性强。与对照组比较，中药组、西药组细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，西药组部分细胞为阴性。提示酶活性明显下降。 采用Tiger图像分析仪测定Mg2+-ATP酶和G-6-P酶阳性细胞平均光密度（AOD）值，与对照组相比，P＜0.01。
5 讨论
中药血清药理学方法是由日本学者于20世纪80年代首先提出来的。是给动物灌服中药一定时间后，取其血清进行实验的药理学研究方法。利用血清药理学方法，给大鼠灌服中药一定时间后，取出血清进行体外实验。能客观反映中药进入体内之后，经过消化、吸收、代谢等过程后发挥药效作用，中药血清药理学提示：中药复方诱导的肿瘤细胞株凋亡具有可靠性和可信性[2]。
本研究证实，4种不同中药复方的中药血清，均能诱导相应肝癌细胞株、A549人肺癌细胞株、CCL-229人大肠癌细胞株和SGC-7901胃癌细胞株发生凋亡，见到典型的形态学特征性指标――凋亡小体[3-4]。
Mg2+-ATP酶是质膜标志酶，主要定位于细胞膜内侧，此酶参与质膜上离子的主动转运，,维持细胞内K+和Na+浓度相对稳定状态,保持细胞膜内、外渗透压平衡以及参与保持细胞内外的化学梯度和跨膜电位，维持细胞内高钾低钠状态，从而保证细胞的活性。本实验中，药物血清作用后细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，提示酶活性明显下降。G-6-P酶是内质网标志酶，是一种多功能酶,是细胞内糖原异生作用中重要酶之一，被称为“代谢标志酶”之一。此酶在糖代谢、免疫球蛋白合成及其它蛋白质合成、浓缩、加工等方面发挥重要作用。本实验中，药物血清作用后细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，有的为阴性。提示酶活性明显下降[5-6]中药血清诱导肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞株酶活性可能是中药复方抗肿瘤的机理之一。笔者同样成功应用本中药血清药理学技术进行了胃癌宁对人SGC-7901胃癌细胞株p53、bcl-2基因表达影响的研究[7]。
（1）给药方案与采血时间。目前存在多种给药方案。但一般使用灌胃方式，也可通过皮肤、黏膜、呼吸道等途径给药。给药时间最短者为1天，最长者为10天；给药次数也各不相同，有每天2次的，也有每天3次的。尽管已有研究表明，连续用药5天和10天所制备的含药血清的生物学效应是相似的，但无论哪种给药方法都必须使药物浓度达到相对平衡状态。根据目前掌握的大量药物的有效成分的药代动力学数据，本实验采用与多数研究者一致的即时血清在实验前禁食12h，次日采用两次给药方式（一次给药后2h等量给药），连续灌胃3天，日两次；采血时相，分别在末次给药后1、2、3h采血。证明是研究中药复方作用肿瘤细胞株较为可靠的血清药理学方法血清[8-9]。（2）含药血清用量。目前中药含药血清的浓度还没有确切的规定，选用5 、10 和20浓度的含药血清进行实验所得结果的说法不一，进行细胞增殖抑制作用的实验采用高浓度的效果好，而进行细胞增殖促进作用的实验采用低浓度的效果好[10]，本研究采用10的平均浓度进行实验，结果较好。当然，最佳血清浓度是因不同实验而异的，故最好的做法是通过预实验来确定。血清药理学可较好地克服了中药粗制剂直接进入体外实验的缺点，其结果的可信度明显优于中药粗制剂直接用于体外实验，不仅提示中药制剂在胃肠内处理过程中活性成分的转化与改变，而且有利于中药真正有效活性部位、有效成分的发现，将有助于促进中药药理现代化的发展，为新药开发奠定能基础。本研究进一步证实，血清药理学方法在诱导肿瘤细胞凋亡、降低酶活性等研究中的应用具有稳定性、可信性。血清药理学方法的应用将更多的相关中药方剂引入抗肿瘤细胞凋亡及诱导细胞凋亡方面的研究，筛选有效的中药成分与其有效组方来达到诱导大量肿瘤细胞凋亡，揭示中药的抗癌机理，为中药治疗肿瘤提供科学、客观和现代的手段与方法，是今后研究的重要内容，对人类攻克肿瘤有着重大意义。
参考文献
[1] Iwama H.Effect of shoszikoto,a Japanese and Chinese traditional herbal medical mixture on the mitogenic activity of lipopolysaccharide.A new pharmacology testing method[J].J Ethonopharmacal,1987,211:45.
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[6] 金春峰，刘春英， 蔡朔，等． 益肺饮对A549人肺癌细胞株酶活性的实验研究[J].中国肿瘤，2004，13（9）：588-590.
[7] 蔡朔，刘芙蓉，刘山．胃癌宁诱导人SGC-7901胃癌细胞株p53、bcl-2基因表达影响研究[J].中华中西医临床杂志，2007，7（2）：9-12.
