生物细胞的作用汇编(三篇)

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篇1

【关键词】 巨噬细胞; γ射线; LPS; S100A8

巨噬细胞在整个免疫反应中起极为重要的作用， 辐射后许多组织和器官损伤都涉及到巨噬细胞的功能异常， 巨噬细胞的辐射效应一直受到重视。巨噬细胞通常具有辐射抗性， 但已有多篇报道证明电离辐射能够促进或直接激活巨噬细胞。一氧化氮（nitric oxide， NO）的生成是巨噬细胞被激活的重要标志， 单纯的射线不能引起小鼠巨噬细胞J774.1和RAW264.7细胞中NO水平的改变， 但0.5～10 Gy 射线预处理能够触发这些巨噬细胞为干扰素γ（interferonγ， IFNγ）和（或）脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导生成NO， 而且呈现剂量效应关系［1］。

钙结合蛋白S100A8是S100蛋白家族成员， 是一个多功能分子， 其最主要的功能是参与免疫炎症反应过程［2］。Stassen等［3］研究发现， 6 Gy X射线照射MCF7细胞后48～72 h， S100A8被诱导表达， 其 mRNA水平呈现辐射剂量效应关系。静息态的巨噬细胞不表达S100A8， 激活状态的巨噬细胞才表达S100A8分子， S100A8在巨噬细胞中为LPS等炎症因子诱导表达［4］。既然S100A8能够为电离辐射及LPS诱导表达， 那么我们需要进一步研究在巨噬细胞中， 电离辐射是否与LPS协同诱导S100A8以及S100A8的表达与巨噬细胞功能状态之间的关系。本研究观察比较了RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h与正常对照、 相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态、 周期、 活性氧介质（reactive oxygen intermediates， ROI）水平、 NO水平及S100A8 mRNA等指标的改变并探讨相互之间的关系。

1 材料和方法

1.1 材料 试剂LPS、 2’7’二氯荧光素双醋酸盐(2， 7dichlorofluorescin dictate， DCFHDA)、 碘化丙啶(propidium iodide， PI)为美国Sigma公司产品。RPMI1640培养基干粉、 胎牛血清、 TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品。随机引物、 MMLV逆转录酶为美国Promega公司产品。BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit为杭州博日公司产品。FACS Calibur 流式细胞仪为美国BD公司产品。Linegene荧光定量PCR检测系统为杭州博日公司产品。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7细胞培养及处理 小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 37℃、 50 mL/L CO2饱和度条件下培养。对数增殖期细胞照射前24 h， 换新鲜培养基， 不辐射或10 Gy 60Co γ射线照射， 照射后24 h， 不加或加入5 mg/L LPS， 继续培养24 h。相差显微镜观察细胞形态变化。

1.2.2 流式细胞术测定细胞周期 乙醇固定骨髓单细胞悬液， PI染色， 流式细胞仪检测， 具体按文献［5］进行。

1.2.3 流式细胞术测定ROI水平 约1×106 RAW264.7细胞铺种于6孔板中， 培养过夜， γ射线或(和)LPS处理后不同时间收集细胞， 用无血清RPMI1640培养液洗2遍细胞后， 20 μmol/L DCFHDA悬浮细胞， 37℃孵育30 min， 无血清RPMI1640培养液洗涤1遍后， 0.5 mL无血清RPMI1640培养液悬浮细胞， 流式细胞仪检测。

1.2.4 NO水平检测 通过Griess颜色反应测定细胞培养上清中NO-2水平， NO-2水平以吸光值A550表示， 具体方法参照文献［1］进行。

1.2.5 实时定量RTPCR检测S100A8表达 用 TRIzol试剂提取RAW264.7细胞总RNA， 经紫外分光仪检测A260和A280， 测定浓度和纯度。取总RNA 2 μg， 随机引物0.5 μg， M MLV逆转录酶200 U， 进行25 μL体系反转录。每PCR反应取2 μL反转录产物为模版， 加入BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit试剂， 于荧光定量PCR检测系统进行实时定量PCR扩增测定CT（Treshhold cycle）值。小鼠S100A8上游引物5′ATCACCATGCCCTCTACAAGA3′， 下游引物5′TGCTACTCCTTGTGGCTGTCT3′。看家基因3磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase， GAPDH）上游引物5′CCATGGAGAAGGCCGGGG3′， 下游引物5′CAAAGTTGTCATGGATGACC3′。用比较CT方法， 以看家基因GAPDH为内参， 以未处理正常细胞中S100A8 mRNA水平为1， 相对定量γ射线或(和)LPS处理后S100A8 mRNA的表达水平。相对表达倍数=2^(-CT)， 其中CT=γ射线或(和)LPS处理样品的CT -正常对照的CT， CT=S100A8的CT-GAPDH的CT 。

1.2.6 统计学分析 所有数据均以x±s表示， 应用SAS9.13统计软件进行两因素析因设计资料的方差分析。

2 结果

2.1 RAW264.7细胞形态学改变 观察比较RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h， 5mg/L LPS继续处理24 h与正常对照、 相应单纯γ射线或单纯LPS处理组细胞形态学变化， 可见正常RAW264.7细胞为圆形， 贴壁生长; 单纯γ射线或单纯 LPS处理的细胞变大， 部分细胞伸出伪足、 呈梭形， 胞内颗粒增多， 两种处理细胞形态学改变类似; γ射线与 LPS共同作用的细胞变得更大， 胞内大量颗粒物， 巨噬细胞呈现被激活状态。

2.2 RAW264.7细胞倍性、 凋亡的改变 正常未处理的RAW264.7细胞中非整倍性（aneuploid）细胞、 凋亡细胞百分数均为0%; 10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h及相应单纯γ射线或单纯LPS处理条件下， 细胞均出现部分非整倍性细胞; 而只在γ射线与LPS共同作用条件下， 细胞才出现明显凋亡（图1）。

2.3 RAW264.7细胞胞内ROI水平的改变 观察10 Gy γ射线照射后0～24 h胞内ROI水平的动态变化， 照后即刻开始升高， 6 h达高峰， 24 h基本恢复到正常水平（图2）， 可见胞内ROI早期生成明显， 随后下降， 因此我们比较细胞受各种处理后6 h， 胞内ROI水平的改变。单纯10 Gy γ射线照射后30 h（即10 Gy γ射线照射后24 h， 0 mg/L LPS继续处理6 h）， 胞内ROI水平不变; 单纯5 mg/L LPS处理后6 h（即0 Gy γ射线照射后24 h， 5mg/L LPS继续处理6 h）， 胞内ROI水平升高; 10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理6 h， 胞内ROI水平明显升高， 从测定数值看， 明显高于单纯5 mg/L LPS处理后6 h或单纯10 Gy γ射线照射后胞内ROI的水平（图3， 图2）。图2 10 Gy γ射线照射后0～24 h胞内ROI水平的变化

2.4 RAW264.7细胞NO水平的变化 单纯γ射线照射， 胞内NO水平不变; 单纯LPS处理条件下， 与正常对照相比， 胞内NO水平升高; 10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h， 胞内NO水平明显升高， 而且高于单纯LPS处理组， 表明γ 射线能够促进LPS增强巨噬细胞RAW264.7中NO水平（图4）。

2.5 RAW264.7细胞中S100A8 分子mRNA表达水平的改变 实时定量RTPCR方法检测胞内S100A8 mRNA水平的变化。以未处理正常细胞中S100A8 mRNA水平为1， 单纯10 Gy γ射线处理条件下， 胞内S100A8 mRNA水平为9.0±2.3; 单纯5 mg/L LPS处理条件下， 胞内S100A8 mRNA水平为86.0±8.3; 10 Gy γ射线与5 mg/L LPS共同作用条件下， 胞内S100A8 mRNA水平为630.0±70.8。可见， γ射线、 LPS均可诱导巨噬细胞RAW264.7中S100A8 mRNA表达， LPS的作用强于γ射线， 而且γ 射线与LPS具有协同作用。

3 讨论

我们的研究表明， RAW264.7细胞受10 Gy γ射线照射后24 h， 5 mg/L LPS继续处理24 h条件下， γ射线与LPS共同作用影响细胞多方面的生物学效应， 具体表现为细胞体积明显变大， 胞内大量颗粒物， 呈现被激活状态; 部分细胞呈现非整倍性， 少量细胞出现凋亡; 胞内ROI水平、 NO水平明显升高; S100A8 分子mRNA水平明显升高， 而且这些效应几乎都比γ射线或LPS单因素的作用要强。

γ射线与LPS共同作用使RAW264.7细胞形态改变， 胞内大量颗粒物的出现可能反应了细胞酶活性的改变。我们检测了RAW264.7细胞受0～40 Gy γ射线照射后0～72 h细胞倍性、 周期、 凋亡的改变， 发现随时间、 剂量不同， 细胞周期呈动态改变， 但细胞几乎不出现凋亡， 只在γ射线与LPS共同作用条件下细胞才出现凋亡， 一定程度说明细胞具有辐射抗性; 部分细胞呈现非整倍性， 而且这部分细胞DNA含量为正常未处理细胞的两倍， 非整倍性的出现可能与细胞分裂受到抑制、 细胞功能的改变或细胞分化状态相关。

ROI和DNA损伤是辐射信号转导中的主要信使分子。我们观察到0～40 Gy射线照射后6 h， RAW264.7细胞胞内ROI水平随照射剂量增加呈现增强趋势， LPS能引起胞内ROI水平升高， 而且 射线的预处理大大增强了LPS引起细胞ROI水平升高的效应。已有的研究表明， 0～10 Gy γ射线照射后24 h， RAW264.7细胞的DNA损伤随受照剂量增加而增强［6］。在 射线促进IFNγ引起J774.1细胞中NO生成的过程中， 第二信使是DNA损伤而非ROI［1］。

S100A8能够为辐射诱导表达， 紫外线诱导小鼠表皮角化细胞中S100A8的表达， ROI参与了此过程［7］。此外， 大鼠肝部受20 Gy射线照射后6 h S100A8蛋白水平升高， 而且该分子的诱导表达可能与受辐射后肝部ROI水平升高有关［8］。我们的研究发现， 单纯γ射线或单纯LPS处理条件下， RAW264.7细胞中S100A8 mRNA水平升高， 而且γ 射线与LPS具有协同作用。我们还检测了通常与S100A8形成复合物行使生物学功能的S100A9分子mRNA的表达， 未能检测到各种处理条件下该分子的表达及变化， 这与已有报道的研究结果一致［3， 4， 7， 8］， 说明S100A8本身具有功能特异性。我们的预实验表明， ROI及转录因子激活蛋白1(activator protein1， AP1)可能参与了辐射诱导RAW264.7细胞中S100A8表达的过程。S100A8与炎症反应密切相关， 那么S100A8诱导表达可能与RAW264.7细胞活性增强有关。此外， S100A8/A9复合物及S100A8、 S100A9具有抑制细胞增殖、 诱导细胞凋亡的功能［9］， γ 射线与LPS能够增强RAW264.7细胞中S100A8表达、 引起该细胞凋亡， 两者之间是否存在某种关联还需要进一步的实验验证。

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篇2

成纤维细胞(fibroblast)是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。

不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位［2，3］。

成纤维细胞形态多样，常见的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm(640?)周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同［4，5］。

处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。

2　成纤维细胞在一般创伤修复中的表现

各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。内脏损伤时，参与修复过程的成纤维细胞多来自间质和包膜，以及粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认为创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞，一方面是由成纤维细胞通过分裂增殖而来，另一方面，更多地是由邻近的间充质细胞、纤维细胞和毛细血管周细胞等演变或游走到伤处。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。在某些病理条件下，以成纤维细胞为主要细胞成分的肉芽组织或增生组织块还可以在非骨组织内发生钙化，引起异位骨化(ectopic ossification)。但对于异位骨化的参与细胞及其机制尚不十分清楚，未分化间充质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和毛细血管周细胞等可划归为诱导性骨祖细胞的细胞都有可能参与这一过程［6，8］。

3　成纤维细胞在骨创伤修复过程中的表现

最简单和常见的骨创伤即是骨折，其愈合过程须经过炎性反应、清扫、纤维骨痂和骨性骨痂4个阶段［4］。不同阶段参与的细胞主体不同。成纤维细胞从骨折第3天起就出现于骨折局部血肿中［6］，骨折后5天即在机化血肿及骨折断端的间隙及其周围大量存在，是参与纤维骨痂阶段的主要细胞成分［4，5］。在此阶段成纤维细胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成和分泌大量Ⅰ型胶原，使肉芽组织逐步变成疏松的结缔组织，将骨断端包围起来，形成接合两骨折断端的巨大的纤维骨痂。然而，这种由无数成纤维细胞和丰富的肉芽组织为主体构成的纤维结缔组织却不会演变为在其它组织创伤修复时常见的瘢痕组织，而是通过钙盐结晶在其内部不断沉积，逐渐演变为骨性骨痂，使骨折局部的修复达到骨性愈合，恢复骨组织的结构。此时，骨折愈合部只有骨组织而不再存在成纤维细胞［4，5，9～11］。

4　成纤维细胞的成骨作用

成纤维细胞在骨折愈合过程中不同于其它组织创伤修复的表现，以及在某些病理条件下可以参与异位骨化［6，7］，使人们对成纤维细胞的分化能力、钙化骨化能力以及在成骨过程中其成骨能力如何发挥、细胞演变的最终归宿如何等等问题产生了浓厚的兴趣。对成纤维细胞成骨能力的研究也正是开始于对骨折愈合过程中成纤维细胞表现的观察。

对骨折局部骨形成区的电镜观察显示，除了成骨细胞在此发挥成骨作用外，成纤维细胞确实也存在着类似的成骨表现［4，5，9～13］。例如，在其线粒体内可清晰见到钙盐颗粒，部分内质网腔内可见成熟的胶原纤维，分泌到其四周的胶原纤维内可见高密度的钙盐结晶沉积。不仅如此，成纤维细胞还能象成骨细胞一样产生基质小泡并引起小泡内的钙盐沉积。钙化的基质小泡形成丛毛球状的钙球，钙球随后合并、融合为骨组织。以上种种现象表明，成纤维细胞与成骨细胞一样具备提供钙盐沉积及骨形成所必需的条件。在从纤维性骨痂到骨性骨痂的演变过程中，成纤维细胞也随之演变为骨细胞，与成骨细胞的归宿相一致。但二者在演变过程中的表现又不尽相同，主要有以下几点可资鉴别［9，13］：①成纤维细胞及其细胞核均呈不规则的椭圆形或长方形，而成骨细胞及其细胞核则为边缘比较光整的椭圆形；②成纤维细胞均单独存在，细胞之间有众多的胶原纤维相隔，成骨细胞则以连续排列的形式出现；③成纤维细胞的细胞质内溶酶体少见，而成骨细胞的细胞质内则常有溶酶体可见；④成纤维细胞四周的骨组织都由丛毛球状钙球或针状钙盐结晶组成，成骨细胞则都有一面紧贴比较成熟与致密的骨组织；⑤成骨细胞是一个一个地被骨组织(类骨质)包围变为骨细胞，而成纤维细胞则可以是两个或两个以上同时被骨组织包围在一个陷窝内，然后再随着细胞之间基质的钙化而分隔为各占一个骨陷窝。

对成纤维细胞的成骨作用，有学者认为这是成纤维细胞的固有特性在骨折这一特定情况下得以表达的结果［9，11］。骨折局部活的和失活的骨组织及软骨组织，以及骨基质中的某些大分子都有可能诱导成纤维细胞表达其成骨作用进而演变为骨细胞［14，15］。较早在骨基质中发现的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein， BMP)即对成纤维细胞有一定的诱导作用。对骨折愈合中BMP作用的研究［16，17］，表明创伤使内源性BMP呈阶段性合成与释放，并诱导周围软组织中的间充质细胞或/和成纤维细胞等向成骨方向转化。应用PAP法发现［16］，骨折后第3、5天局部纤维肉芽组织中的成纤维细胞样间充质细胞内以及第14天新生骨小梁间纤维组织中的成纤维细胞样间充质细胞内，都与成骨细胞、软骨细胞和骨基质一样存在BMP，表明这些成纤维细胞样间充质细胞已被诱导为可合成分泌BMP、具有成骨作用的细胞。而Sampath［15］从牛骨基质中分离提纯得到的成骨素对成纤维细胞的骨诱导能力更是超过了BMP和当时已知的其它骨生长因子。转贴于

成纤维细胞在其成骨作用得以表达后，可能通过两种方式成骨：①膜内成骨；②在环绕软骨的纤维层内成骨。开始分泌胶原纤维后，参与成骨的成纤维细胞只有两个归宿［4，5，9，13］：①变性、死亡、碎裂直至消失，这种演变发生早、范围广，故从纤维性骨痂形成开始，就逐渐有基质成分发生钙化，进而转变为骨基质；②演变为骨细胞，这一过程出现较晚，并穿插在前一过程之中，故在形成骨组织的细胞成分的同时，还使丰富的纤维骨痂演变为骨性骨痂，形成骨组织。但这种由成纤维细胞演变成的骨细胞，其结局如何、其生物学特性与由成骨细胞演化而来的骨细胞是否相同仍不清楚。例如，骨细胞从骨陷窝脱离后，可恢复为功能活跃的成骨细胞，再次参与骨组织的形成；而由成纤维细胞演变成的骨细胞在脱离骨陷窝后，是成为成骨细胞还是恢复为成纤维细胞、此时是否还具备成骨作用等一系列问题尚缺乏研究。

5　成纤维细胞体外培养的生物学特性［18］

成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。

成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍。通常，以酶消化法获得的成纤维细胞悬液在接种后5～10min即可见细胞以伪足初期附着，与底物形成一些接触点；然后细胞逐渐呈放射状伸展，胞体的中心部分亦随之变扁平；最快者大约在接种后30min，细胞贴附底物即较为完全，呈现成纤维细胞的形态。采用组织块法则大约在接种后2～3天［2，3］到1周左右，在接种的皮肤组织块周围长出细胞。待细胞融合成片，铺满培养容器底壁大部分时即可进行传代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，将成纤维细胞从底壁消化下来后分瓶作传代培养。成纤维细胞在体外培养条件下能保持良好的分裂增殖能力。细胞分裂时变为球形；分裂后又平铺在附着物的表面成为有突起的扁平细胞。体外培养的成纤维细胞，其生命期限与物种等因素有关。例如：人胚成纤维细胞约可培养50代；恒河猴皮肤成纤维细胞能传代超过40代；鸡胚成纤维细胞则只有少数能培养30代；而小鼠成纤维细胞多数只能生长8代左右。另外，从老年个体取得的成纤维细胞的寿命要比取自年轻者短。由于在细胞传代和进行体外培养时，细胞的生物学特性会逐渐发生一些不同于体内的改变，故通常只将前10代视这正常细胞，可在此时将生长旺盛的成纤维细胞冻存起来，以备将来复苏使用，这在将培养的细胞由动物实验向人体实验过渡的过程中必须给予足够的重视。

6　成纤维细胞在体外培养中的成骨作用

徐荣辉［2］等通过体外培养家兔皮肤成纤维细胞发现，经传代培养的成纤维细胞至第8天时，其细胞集落中有不透光的骨小结节形成；到37天时，小结节扩大、延伸，形成骨小梁样结构。经活体四环素标记显示，所形成的结构为新生骨组织。他们还注意到，成纤维细胞在参与骨形成的过程中并无分化为成软骨细胞或成骨细胞的明确迹象，故推测并未发生此种分化，而成纤维细胞之所以能发挥成骨作用，很可能是受某些诱导因素作用的缘故。他们认为用以培养成纤维细胞的中厚皮片中混杂存在的上皮细胞(或/与内皮细胞)，可能是诱导成纤维细胞形成骨组织的一种诱导因素。而Friedenstein［6，19］较早的实验则认为，属于诱导性骨祖细胞之一种的成纤维细胞，在上皮细胞(如膀胱上皮)或脱钙骨基质等诱导因子作用下，可以分化为成骨细胞进而形成骨组织。邓廉夫［20］等分离培养取自关节内的损伤性和晚期骨关节炎性的滑膜细胞，发现其中的成纤维细胞样细胞增殖迅速，呈束状或交叉铺展并可形成多层结构，细胞表面有其分泌物形成的不透光结节，经四环素标记、ARS(Alizarinred s)和甲苯胺蓝(Toluidine blue)染色，显示结节为新生骨组织。在缺乏常规的诱导因子——上皮细胞的作用下，取自滑膜的成纤维细胞样细胞也能发生成骨作用，他们推测是在关节损伤后或骨关节炎的发生与发展过程中，改变的关节微环境(如TNF样活性物质增多等)可能会触发滑膜的成纤维细胞与骨形成相关的多基因表达，使其向成骨型细胞分化，这样，滑膜成纤维细胞样细胞在体内时即已具备成骨性能，故在培养条件下可发挥成骨作用。Dodda［21］等的研究则指出，变性滑膜细胞多种细胞因子和生长因子的表达、关节液内多种细胞因子的出现，可能是滑膜成纤维细胞样细胞成骨表型表达的重要始动因素。这些相关的研究表明成纤维细胞成骨表型的表达可能存在着较复杂的调控机制，而其诱导因素也是多样的。

为获取大量具有成骨表型的成纤维细胞并了解其转化机制，邓廉夫［22］等将分离纯化的人皮肤成纤维细胞置于加有不同浓度EGF、IL-6、TNF-α、BMP-2的培养液中进行体外培养，采用生物化学、组织化学和电镜观察等方法检测成纤维细胞成骨性标记物的形成状况，发现TNF-α和BMP-2联合应用，可使成纤维细胞分泌碱性磷酸酶、骨钙素及胶原纤维的量增加；成纤维细胞可由梭形向圆形或多突形转化，蛋白分泌旺盛；细胞外基质中，丰富的胶原纤维定向或杂乱排列，其间散在较多的钙颗粒；细胞可重叠交织形成多层结构，其表面有分泌颗粒和钙盐结晶堆积，并不断融合扩大成骨结节，表明TNF-α和BMP-2可以诱导成纤维细胞成骨。但这种完全由成纤维细胞经诱导而形成的骨组织，在缺乏典型的成骨细胞参与下是否能在体外或植入体内后经改建成为成熟的板层骨及其改建过程如何?仍有待进一步研究。

7　展望

尽管成纤维细胞受哪些因素诱导可以产生成骨作用、这些因素的诱导方式及其机制如何以及成纤维细胞在骨形成中是否分化为成骨细胞等等问题尚未完全解决，但成纤维细胞经诱导可以形成骨组织这一现象已逐渐为广大科学工作者所接受。由于成纤维细胞直接参与了骨折愈合过程中纤维性骨痂的形成，其自身又具备被诱导成骨的能力，可以设想，利用成纤维细胞分布广泛、取材方便、对机体损伤较小、体外培养容易成活、增生繁殖较快等较其它具有成骨作用的细胞(如骨膜成骨细胞、骨髓基质细胞等)优越之处，在体外大量培养扩增成纤维细胞，并施以有效的诱导因素(如上皮细胞、TNG-α和BMP等)使其具备成骨效能，然后与合适的生物材料载体复合，同时使该复合体在体外或体内保持良好的成骨能力并进行一定程度的成骨，则有望获得具有一定的生物力学支撑强度而成骨作用又保持活跃的“活骨”复合体，用以替代自体骨或异体骨回植体内治疗难以自身修复的较大的骨缺损，这无疑将为骨缺损的修复治疗开辟一条新的有辉煌前景的道路。在组织工程技术和生物材料科学已有较大发展的今天，这一设想是极有可能实现的。当然，从目前所处的实验阶段过渡到临床应用尚有很大一段距离，需要解决的问题还很多，而且随着研究的展开和深入，问题可能还会越来越多，但这确实是一项很有临床应用价值和社会、经济效益的重大课题，值得广大基础医学工作者和临床科研人员为之而努力。

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篇3

[中图分类号] R782.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）15-0053-03

溶胶-凝胶生物活性玻璃是一种含有硅、钠、钙和磷等成分的透明生物活性材料[1]，医用开发的生物活性玻璃具有与天然骨类似的组成，生物相容性好，可与生物组织产生直接的化学结合，植入人体后可参加新陈代谢使骨组织生长，是一类可以与骨组织良好键合的骨修复材料[2]。已发现生物活性玻璃能够促进人成骨细胞增殖[3]。

磁力在20世纪70年代后期被引入正畸学领域以来，就备受关注[4]。研究表明， 0.062 T的静磁场可以促进成骨细胞的增殖[5]。由于以往多为单独研究生物活性玻璃或静磁场对成骨细胞的影响，本研究初次探讨静磁场结合溶胶-凝胶生物活性玻璃同时对成骨细胞的作用，观察成骨细胞在两者共同作用下的增殖性，推断其对牙槽骨改建的潜在影响[6]，为正畸临床医生矫治错畸形患者寻找更好的治疗方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 静磁场的设计 参考仇丽鸿等[7]的方法，将两块钕铁硼永磁体（15 cm×9 cm×2 cm）充磁后分别固定于特制的长方形盒子（15 cm×9 cm×2 cm）内。在长方形盒子的间位置可放置96孔细胞培养板，调节96孔细胞培养板及两块钕铁硼永磁体之间的位置关系， 应用特斯拉测定仪测定培养板底部的磁场强度， 使其磁场强度为 0.062 T。

1.1.2 生物活性玻璃 采用溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃58S，由华南理工大学材料学院提供。

1.1.3 实验细胞 Wistar大鼠成骨细胞株由上海拜力生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 溶胶-凝胶生物活性玻璃的配制 将粉末状的溶胶-凝胶生物活性玻璃 58 S高温高压灭菌后，按1 mg/mL浓度配入培养基，静置24 h后，用0.22 μm过滤膜过滤，最后将其浸提液按1：9稀释10倍待用。

1.2.2 分组方法 复苏Wistar大鼠成骨细胞株，并传代培养至第4代后随机分为四组： ①空白组：成骨细胞培养组；②溶胶-凝胶生物活性玻璃实验组：溶胶-凝胶生物活性玻璃溶剂内成骨细胞细胞生长组；③静磁场作用下成骨细胞实验组：0.062 T静磁场作用下成骨细胞生长组；④静磁场作用下溶胶-凝胶生物活性玻璃实验组：0.062 T静磁场作用下，溶胶-凝胶生物活性玻璃溶剂内成骨细胞生长组。

1.2.3 细胞增殖（MTT）的测定 用含 5%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 104个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 100 μL，每个样本做 3 个复孔。37℃、5 mL/L CO2培养箱中培养24 h、48 h、72 h、120 h。每孔加 MTT 溶液（5 mg/mL用 PBS 配制，pH=7.4）20 μL。继续孵育4 h，终止培养，小心吸取孔内培养上清液。每孔加 150 μL DMSO，振荡 10 min，使结晶物充分溶解。选择 490 nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 13.0 统计软件处理。差异分析应用方差分析和t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

见表1。随着细胞培养时间的增加，各组细胞出现不同程度的增殖，通过任意两组组间比较t值在24 h、48 h、72 h、120 h时间点的比较，可知四组间成骨细胞在24 h、48 h、72 h、120 h各个时间点的增殖性存在显著性差异。本研究结果表明，与空白组相比，三个实验组的增值率在48 h之前均呈现递增趋势，48 h之后均呈现递减趋势，在48 h达到最高点；并且成骨细胞的增殖率在48 h时，58 S溶胶-凝胶生物活性玻璃与0.062 T静磁场共同作用组最高。

3 讨论

随着生物磁技术与人工材料的发展，有关磁场、人工材料作用与生物学效应的研究，取得了积极的成果，各类磁场强度治疗及生物活性玻璃在医学中的基础和临床应用研究越来越广泛。但是有关静磁场和生物活性玻璃对骨组织作用和相关代谢机制的研究较少[8]。课题组首次应用体外研究探讨静磁场加生物活性玻璃同时对成骨细胞增殖的影响，为今后进一步基础及临床研究打下基础。

本研究结果表明，与空白组相比较，0.062 T磁感应强度的静磁场、溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃58S、以及二者共同作用，在这三种因素作用下，成骨细胞增殖率均在48 h之前呈现递增趋势，48 h之后均呈现递减趋势，在48 h时达到最高点；58S溶胶-凝胶生物活性玻璃与0.062 T静磁场共同作用组的成骨细胞增殖率在任何时间点均高于其余三组。由本实验研究可得出，磁感应强度为0.062 T的静磁场与溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃58S相互协调、共同作用，对成骨细胞的增殖起到相互加强的作用。

成骨细胞不仅是骨形成的主要效应细胞，而且对破骨细胞的分化和成熟具有重要调控作用，因此在骨改建的过程中处于一个中心调控的地位。牙-牙槽骨独特的生物学特性是正畸牙得以移动的基础。0.062 T磁感应强度的静磁场与溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃58 S相互协调、共同作用时，更强地促进成骨细胞的增殖。而增殖是生物体最根本的生命活动，对于骨缺损、骨吸收等骨性疾病，促增殖作用显得尤为重要，由此静磁场加生物活性玻璃可更好地促进牙槽骨的改建，这为今后静磁场加生物活性玻璃在临床正畸治疗上的应用研究奠定基础。

[参考文献]

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