发布时间：2023-10-13 15:37:04
绪论：一篇引人入胜的统计学特性，需要建立在充分的资料搜集和文献研究之上。搜杂志网为您汇编了三篇范文，供您参考和学习。
【关键词】 SLE; 角质形成细胞; CCK-8; 凋亡; 细胞周期
Abstract： 【Objective】 To observe the cytologic characteristics of keratinocytes (KC) from lesion of systemic lupus erythematosus (SLE) patients in vitro. 【Methods】 KC from lesions of SLE patients and healthy people (control group) were cultured in vitro and identified by detecting Pan cytokeratin with immunofluorescence. Features of the keratinocytes were analyzed with invert microscope. Two-step digestion when passaging was used to purify cell line. CCK-8 was used to assay growth kinetics of the keratinocytes and come up with a growing curve after continuous analysis for two weeks. Cell circle and apoptosis were observed by flow cytometry. 【Results】 KC was cultured in vitro successfully. Concerning passage 2， over 95% of the cells from primary culture were positive for cytokeratin. Comparing with KC from healthy people， KC from SLE lesions needed more time (7 d vs. 4 d) to reach exponential growth phase (EGP)， but grew faster in EGP. Both cell count at S phase and apoptosis rate of KC from SLE lesions elevated， when comparing with that of the control group. 【Conclusion】 Keratinocytes from lesions of SLE patients are abnormal cytologically. It might be a vital cause of skin lesion of SLE， and a priming of SLE.
皮肤损害具有特征性而常见。据统计，55% ～ 85% SLE患者出现皮肤损害[1]，这种损害出现得早[2]，往往在系统损害发生之前就出现，故为狼疮早期诊断的重要线索。SLE可出现多种皮损，主要为红斑，包括常见的碟形红斑、播散性红斑，肢端红斑等，发病机制尚未明朗，相关研究少。对狼疮皮损发病机制的认识有助于进一步解析狼疮的发病机理，为狼疮的诊断及治疗提供依据和参考。本课题组之前通过蛋白组研究发现[3]：SLE皮损角质形成细胞表达多种异常蛋白，推测与狼疮的发病相关。红斑狼疮皮肤损害究竟是继发症状还是始发、独立的致病因素，值得深入研究和探讨。本实验通过原代培养系统性红斑狼疮皮损的角质形成细胞，观察其细胞学特性，发现SLE患者皮损角质形成细胞的生物学行为存在异常，可能为狼疮皮疹发生的重要原因，也可能与狼疮的发病密切相关。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 标 本
10例SLE皮损标本取自我科门诊或住院患者，均为确诊SLE的女性患者(系统性红斑狼疮1982年诊断标准)，且具有皮肤损害(红斑)，平均年龄28.3(S = 5.1)岁，标本均取自背部，狼疮带试验(lupus band test，LBT)阳性;10例正常表皮标本取自我院门诊手术室，为接受手术治疗的脂肪瘤或粉瘤女性患者，平均年龄27.4(S = 5.5)岁，标本也均取自背部，表皮健康。患者知情并同意。
1.1.2 主要设备
美国Shellab CO2培养箱;日本Nikon 荧光倒置显微镜;流式细胞仪(FACScan，BD Biosciences); Labsystems Dragon酶标仪(Wellscan MK 3)。
1.1.3 试 剂
Dispase(分散酶)、K-SFM(serum-free keratinocyte medium)购自美国GIBCO公司;鼠抗人角蛋白一抗(mouse anti-Pan cytokeratin)及荧光二抗购自武汉博士德公司;CCK-8(cell counting kit-8)购自日本同仁公司;凋亡检测试剂盒购自奥地利Bender Medsystems公司。
1.2 方 法
1.2.1 角质形成细胞的原代培养
标本去除皮下组织后剪成8 mm × 3 mm大小，稀释5倍的双抗PBS(含青霉素/链霉素，500 U/mL)浸泡1 h后，PBS清洗3次。加入1.6 U/mL dispase中4 ℃消化过夜。第2天剥离表皮置于2.5 g/L胰蛋白酶 + 0.2 g/L EDTA(1：1)中消化10 min，含100 mL/L FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)的DMEM培养基终止消化，反复吹打后过筛，得角质形成细胞悬液，低速离心(1 000 × g， 5 min)，K-SFM重悬后，按1 × 105/mL浓度接种6孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。
1.2.2 细胞传代及纯化
细胞培养至 > 70%融合时予传代，先用2.5 g/L胰蛋白酶预消化6 min，在成纤维细胞、老化的角质形成细胞(贴壁能力差)被消化而浮起，具活力的角质形成细胞(贴壁能力强)收缩、变圆，但尚未浮起时，吸走消化液，以去除成纤维细胞及老化的角质形成细胞;然后再用2.5 g/L胰蛋白酶 + 0.2 g/L EDTA(1 ∶ 1) 混合液消化3 min， > 90% 角质形成细胞浮起时，含血清(FBS 100 mL/L)完全DMEM培养基终止消化。经PBS洗涤后，K-SFM重悬，调整细胞悬液浓度，接种、传代。
1.2.3 角质形成细胞的鉴定及纯度计算
胰酶消化第一代原代细胞接种于48孔板，于指数生长期进行免疫荧光检测：40 g/L多聚甲醛溶液固定细胞后，10 mL/L的triton处理5 min，30 mL/L BSA(bovine serum albumin，牛血清白蛋白) 37 ℃封闭半小时后加抗人角蛋白一抗(mouse anti-Pan cytokeratin)，4 ℃过夜，PBS洗3次，二抗孵育1 h，DAPI染色5 min后，荧光显微镜下观察、计数。纯度评价：随机取5个互不重叠的高倍视野(200 ×)，分别于绿色和蓝色荧光下，计算(胞浆)免疫荧光阳性细胞数和总的细胞数(细胞核数)，并根据结果计算阳性细胞占总细胞数的比例。
1.2.4 生长曲线
第二代角质形成细胞以5 × 103/孔接种于96 孔板，每孔加CCK-8 10 μL，37 ℃孵育3 h后，酶标仪检测D (450 nm)。每48 h检测一次，连续14 d于同一时间点进行观察，每组设4个复孔。
1.2.5 细胞周期及凋亡
使用流式细胞仪分析第二代指数生长期角质形成细胞的细胞周期和凋亡情况。首先按2.5 × 104/cm2密度接种6孔板，培养至第7天时(70%融合)消化细胞，制备成浓度为1 × 106/mL单细胞悬液，70%冻乙醇 -20 ℃过夜，第2天PI(碘化丙啶)染色后，流式细胞仪进行DNA含量测定，细胞周期分析。凋亡检测则用binding buffer制成2 × 105/mL浓度细胞悬液，采用FITC标记的AnnexinV(钙磷脂结合蛋白Ⅴ)和PI双染后上流式细胞仪进行检测。每组平衡实验3次。
1.2.6 统计学分析
实验数据以x ± s表示，使用SPSS 16.0进行统计分析，两组数据间比较采用t检验，P < 0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 角质形成细胞的原代培养
原代培养约第24小时可见圆形或椭圆形角质形成细胞贴壁，同时可见少量蜘蛛状或树根状细胞(图1)。48 h小集落形成。集落逐渐增大，向外扩增、延伸，并互相融合，最终可连接成片，呈典型的“铺路石”状(图2)。达70%融合时，进行传代培养。传代后，细胞生长加快。
2.2 角质形成细胞的鉴定和纯度计算
角质形成细胞胞浆显示亮绿色荧光(图 3)。荧光显微镜下计数并进行纯度计算，SLE皮损角质形成细胞和正常对照组的阳性率分别为：(96.8 ± 1.9)% vs.(97.5 ± 1.27)%(t = -1.04，P > 0.05)。
2.3 生长曲线
对比SLE皮损角质形成细胞和正常对照组角质形成细胞的生长曲线(图 4)，SLE皮损角质形成细胞进入指数生长期慢(7 d vs. 4 d)，但进入指数增长期后，其增殖能力较正常皮肤角质形成细胞强，生长迅速(曲线斜率大)。
2.4 细胞周期及凋亡分析
与正常皮肤角质形成细胞相比，SLE皮损角质形成细胞 S 期细胞比例为：(40.68 ± 1.81)% vs. (34.43 ± 1.24)% (t = 9.005，P < 0.01)(图5A，B);同时，指数生长期凋亡率为：(6.08 ± 0.72)% vs.(4.32 ± 0.44)%(t = 6.606，P < 0.01)(图6A，B)。
3 讨 论
作为系统性红斑狼疮最常见的损害之一，皮肤损害因出现早，且与病情密切相关[4]，在狼疮的诊断及治疗中有着重要的意义。皮损的状况可以直接反映狼疮的活动情况，为判断病情，也为疗效的观察提供了重要的临床线索。在狼疮皮损发病机制的研究方面，过去集中在免疫复合物的沉积[5-6]，及其继发的血管病变。本科室先前研究发现：皮损内沉积的DNA抗原与循环免疫复合物中的抗原并不完全相同[7]，提示皮肤组织的异常可能为引发红斑狼疮的独立因素，是狼疮引起皮肤损害，还是皮肤改变诱发了狼疮?值得深入研究。我们利用蛋白组技术对系统性狼疮皮损角质形成细胞的蛋白质进行全面分析发现[3]：与正常相比较，红斑狼疮患者皮损角质形成细胞中存在多种异常蛋白，提示红斑狼疮皮损角质形成细胞存在异常，可能为狼疮皮损乃至狼疮发病的重要因素。为进一步了解系统性红斑狼疮皮损角质形成细胞的异常情况，掌握其生物学特性，本研究通过体外培养系统性红斑狼疮皮损部位的角质形成细胞，观察其细胞学特性，并与正常皮肤来源的角质形成细胞进行比较。
因为标本量少(一般从病理取材的过程中取得)，且本身处于病态(基底细胞液化)，所以SLE皮损角质形成细胞原代培养难度大，适当增加标本量，取低年龄段患者( < 30岁)及尽量缩短胰酶的消化时间有助于提高成功率。使用dispase可以很好地分离真表皮(推荐4 ℃消化过夜)，得到纯度较高的角质形成细胞，传代过程中，通过不含EDTA的胰酶预消化，去除树根状细胞和老化的角质形成细胞，实现对角质形成细胞的人工纯化，并且可以减少消化对细胞的损伤，提高传代后的贴壁率。实验通过对角蛋白的荧光染色、计数，证实第二代角质形成细胞纯度 > 95%，SLE组和正常对照组间差异无统计学意义。
通过CCK-8观察角质形成细胞的增殖情况并绘制生长曲线我们发现：相同条件下，SLE皮损的角质形成细胞较正常角质形成细胞进入指数生长期慢(7 d vs. 4 d)，但一旦进入指数生长期，其增殖速度较正常角质形成细胞快。细胞周期分析也支持这一结果，检测指数生长期中角质形成细胞的细胞周期发现：SLE皮损角质形成细胞处于S期细胞比例高，提示增长、分裂较正常角质形成细胞快。凋亡分析发现，与正常角质形成细胞相比，SLE皮损角质形成细胞凋亡率高，这可能与快速增殖有关[8]。结合先前研究结果，我们可以假设：SLE皮损角质形成细胞进入指数生长期后，处于异常的高增长与高凋亡状态，其凋亡所产生的细胞碎片、成分(含有多种异常蛋白)成为自身抗原，经过抗原提呈系统的处理、提呈，激活机体的免疫系统，引起自身免疫的发生。进入指数生长期缓慢可能与继发的炎症攻击和损伤有关。因此，角质形成细胞的异常生物学行为可能是SLE发病(或SLE皮损发病)的原发、始动因素，值得进一步深入研究。
本实验从细胞学的角度研究了SLE皮损角质形成细胞体外培养的基本生物学特性，为进一步研究狼疮皮损乃至狼疮的发病提供一些基础的信息，为下一步研究作铺垫。
参考文献
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一、关于统计学
统计学是一门实质性的社会科学，既研究社会生活的客观规律，也研究统计方法。统计学是继承和发展基础统计的理论成果，坚持统计学的社会科学性质，使统计理论研究更接近统计工作实际，在国家和社会得到广泛发展。
二、统计学中的几种统计思想
2.1统计思想的形成
统计思想不是天然形成的，需要经历统计观念、统计意识、统计理念等阶段。统计思想是根据人类社会需求的变化而开展各种统计实践、统计理论研究与概括，才能逐步形成系统的统计思想。
2.2比较常用的几种统计思想
所谓统计思想，就是统计实际工作、统计学理论及应用研究中必须遵循的基本理念和指导思想。统计思想主要包括：均值思想、变异思想、估计思想、相关思想、拟合思想、检验思想。现分述如下：
2.2.1均值思想
均值是对所要研究对象的简明而重要的代表。均值概念几乎涉及所有统计学理论，是统计学的基本思想。均值思想也要求从总体上看问题，但要求观察其一般发展趋势，避免个别偶然现象的干扰，故也体现了总体观。
2.2.2变异思想
统计研究同类现象的总体特征，它的前提则是总体各单位的特征存在着差异。统计方法就是要认识事物数量方面的差异。统计学反映变异情况较基本的概念是方差，是表示“变异”的“一般水平”的概念。平均与变异都是对同类事物特征的抽象和宏观度量。
2.2.3估计思想
估计以样本推测总体，是对同类事物的由此及彼式的认识方法。使用估计方法有一个预设：样本与总体具有相同的性质。样本才能代表总体。但样本的代表性受偶然因素影响，在估计理论对置信程度的测量就是保持逻辑严谨的必要步骤。
2.2.4相关思想
事物是普遍联系的，在变化中，经常出现一些事物相随共变或相随共现的情况，总体又是由许多个别事务所组成，这些个别事物是相互关联的，而我们所研究的事物总体又是在同质性的基础上形成。因而，总体中的个体之间、这一总体与另一总体之间总是相互关联的。
2.2.5拟合思想
拟合是对不同类型事物之间关系之表象的抽象。任何一个单一的关系必须依赖其他关系而存在，所有实际事物的关系都表现得非常复杂，这种方法就是对规律或趋势的拟合。拟合的成果是模型，反映一般趋势。趋势表达的是“事物和关系的变化过程在数量上所体现的模式和基于此而预示的可能性”。
2.2.6检验思想
统计方法总是归纳性的，其结论永远带有一定的或然性，基于局部特征和规律所推广出来的判断不可能完全可信，检验过程就是利用样本的实际资料来检验事先对总体某些数量特征的假设是否可信。
2.3统计思想的特点
作为一门应用统计学，它从数理统计学派汲取新的营养，并且越来越广泛的应用数学方法，联系也越来越密切，但在统计思想的体现上与通用学派相比，还有着自己的特别之处。其基本特点能从以下四个方面体现出：（1）统计思想强调方法性与应用性的统一；（2）统计思想强调科学性与艺术性的统一；（3）统计思想强调客观性与主观性的统一；（4）统计思想强调定性分析与定量分析的统一。
三、对统计思想的一些思考
3.1要更正当前存在的一些不正确的思想认识
英国著名生物学家、统计学家高尔顿曾经说过：“统计学具有处理复杂问题的非凡能力，当科学的探索者在前进的过程中荆棘载途时，唯有统计学可以帮助他们打开一条通道”。但事实并非这么简单，因为我们所面临的现实问题可能要比想象的复杂得多。此外，有些人认为方法越复杂越科学，在实际的分析研究中，喜欢简单问题复杂化，似乎这样才能显示其科学含量。其实，真正的科学是使复杂的问题简单化而不是追求复杂化。与此相关联的是，有些人认为只有推断统计才是科学，描述统计不是科学，并延伸扩大到只有数理统计是科学、社会经济统计不是科学这样的认识。这种认识是极其错误的，至少是对社会经济统计的无知。比利时数学家凯特勒不仅研究概率论，并且注重于把统计学应用于人类事物，试图把统计学创建成改良社会的一种工具。经济学和人口统计学中的某些近代概念，如GNP、人口增长率等等，均是凯特勒及其弟子们的遗产。
3.2要不断拓展统计思维方式
统计学是以归纳推理或归纳思维为主要的逻辑方式的。众所周知，逻辑推理方式主要有两种：归纳推理和演绎推理。归纳推理是基于观测到的数据信息(尤其是不完全甚至劣质的信息)去产生新的知识或去验证一个假设，即以所掌握的数据信息为依据，归纳得出具有一般特征的结论。归纳推理是要在数据信息的基础上透过偶然性去发现必然性。演绎推理是对统计认识能力的深化，尤其是在根据必然性去研究和认识偶然性方面，具有很大的作用。
3.3深化对数据分析的认识
任何统计研究都离不开数据分析。因为这是得到统计研究结论的必要环节。虽然统计分析的形式随时代的推移而变化着，但是“从数据中提取一切信息”或者“归纳和揭示”作为统计分析的目的却一直没有改变。对统计数据分析的原因有以下三个方面：一是基于同样的数据会得出不同、甚至相反的分析结论；二是我们所面对的分析数据有时是缺损的或存在不真实性；三是我们所面对的分析数据有时则又是海量的，让人无从下手。虽然统计数据分析已经经历了描述性数据分析(DDA)、推断性数据分析(IDA)和探索性数据分析(EDA)等阶段，分析的方法技术已经有了质的飞跃，但与人类不断提高的要求相比，存在的问题似乎也越来越多。所以，我们必须深化对数据分析的认识，围绕“准确解答特定问题并且从数据中获取一切有效信息”这一目的，不断拓展研究思路，继续开展数据分析方法技术的研究。
参考文献：
[1]陈福贵.统计思想雏议[J]北京统计,2004,(05).
中职语文学科是中职教育阶段一门非常重要的学科。它是对学生进行正确的思想教育，教给学生正确地理解、掌握和运用祖国语言文字的专门课程。努力上好语文课，是每一个中职语文教师义不容辞的责任。与普通院校的语文课程不同，中职语文有其特有的知识系统特点。本文先分析中职语文知识系统特点，接着分析如何在中职语文教学中进行个性化教学，希望能为提高中职语文教学质量献出绵薄之力。
一、中职语文知识系统特点
2009年，国家教育部在《中等职业学校语文教学大纲》中明确指出：中职院校以培养符合社会需求的初、中级技术人才为办学目标，这类技术人才要能够适应生产、服务、管理第一线的需要。所以语文学科的教学也应该紧紧围绕社会需求而展开，以就业为本位，将语文教学与学生就业有机结合在一起，为他们日后走上工作岗位夯实基础。只有这样，才能使中职语文学科成为学生终身学习的工具。从目前来看，中职语文知识系统特点体现在以下几点：
1、鉴于中职培养目标是为社会输送大批合格的专业技术劳动者，使学生具备实践技能和动手能力，所以中职语文教学并非是要培养文学、语言学等专门人才，而是要培养学生的基础性语文知识和能力，为他们学好专业知识奠定基础。
2、中职院校的学生知识基础比较薄弱，对学习没有非常强烈的兴趣。这就要求中职语文教学不能仅依靠教材内容，中职语文教师要为他们安排特色鲜明的、为专业学习服务的语文教学资源，让学生接触的语文知识贴近他们的实际生活，方能引起他们的求知欲。
3、普通学校的语文知识系统多注重文化性与逻辑性，但是中职院校以培养技术型人才为目标，所以中职语文知识系统要以就业为本位，凸显社会用人单位对中职人才的要求，比如在中职语文教学中要渗透职业道德和职业素质教育，促使中职生树立爱岗敬业、艰苦奋斗、勇往直前、诚实守信的人生理念。
二、如何在中职语文教学中进行个性化教学
鉴于中职语文知识系统的特点，要进行个性化教学科从以下几点入手：
1、科学管理课堂教学
在中职语文教学中坚持个性化教学，必须做到有的放矢，要明确教学目标，避免教学盲目性。从中职一年级开始，直至学生毕业，中职语文教师都应该明确学生应达到的基本总目标以及这些总目标如何分解到每一学年，每一学期，每个单元，甚至每一堂课。教师可以用一种直观的、简洁的形式，如目标树、目标表格等形式把它们画出来，以随时检验自己的教学。要让学生明白他们这三年必须达到的语文知识、能力、认知等各方面的目标以及各分解目标，并随时通过各种方式让学生自己检验这些目标的达标情况，从而从根本上提升学生的语文能力，为他们的日后发展奠定扎实的基础。
2、加强听说训练
随着我国经济的日趋繁荣，人口流动的日益频繁，信息交流的日趋广泛，听、说能力已成了一个人的基本能力。中职生不管是升学去外地读书，或是不升学去外地打工，没有基本的听、说能力是举步维艰、苦不堪言的。听、说技能已成了中职生最基本的语文素质，成了学生最基本的生活需要。鉴于中职语文教学的特殊性，我们应该在教学中加强听说训练。我们可以通过读报、讲故事，然后让学生写内容提要，写故事梗概，找中心论点等各种形式训练听力，把听与写结合起来。同时也可以让学生相互谈心、问答、辩论，把听与说结合起来，在提高学生听话能力的同时也提高了学生写作和说话能力。
3、开辟语文第二课堂
针对目前中职语文教学信息闭塞，观念陈旧，课堂封闭等现状，我们必须坚持“大语文”教学观，打开封闭的语文课堂教学，走进生活去学习语文。我们根据中职生学生知识面窄，底子薄，综合能力、听说能力低等特点，在课外活动内容的安排上，可以课外阅读活动为主，开展包括朗诵、读报、讲故事、景物观察等活动，在高年级或水平相对较高的班级可开展社会调查、问题研讨会、辩论会、演讲会、课本剧演出、影视评论会等活动。一言以概之，课外活动的内容形式需根据教师自身的水平和学生的水平而定，但无论如何课外阅读都应成为语文课外活动的主要内容。
总之，课堂教学质量低是语文教学的通病，但中职语文教学尤为突出。中职语文知识结构有其自身的特殊性，中职语文教师要根据中职生的实际情况开展个性化教学，明确教学目标，加强听说训练，并积极开辟第二课堂，层层深入，使中职生真正实现全面发展。
作者简介：樊琦（1981年12月）、女、汉族、籍贯湖南衡阳、东莞理工学校、中级讲师、硕士、学士学位、研究方向：中职语文教学
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