发布时间：2023-09-27 15:06:10
绪论：一篇引人入胜的艺术审美的重要性，需要建立在充分的资料搜集和文献研究之上。搜杂志网为您汇编了三篇范文，供您参考和学习。
【摘 要】 当代艺术作品中的审美刺激性，对艺术家来说这是一种考验，它需要艺术家敏锐的社会洞察力和细腻的事物感知力；对于我们社会大众来说这是一场全身心的视听新体验，在我们当下所处的这个图像与信息爆炸的特殊时代，审美刺激性是人们所迫切需要的。
人的眼睛总是在大脑的指挥下进行有选择性的看，缺乏刺激性的事物是不能吸引人的注意力的，这也就是我们通常说的看不代表看见，听也不代表听见。在这个信息爆炸的时代，人们的耳朵和眼睛经常高频率地接收着各式各样的信息，视觉和听觉在大量的信息冲斥下会显得十分疲软。熟视无睹的人们内心深处一如既往地追求着理想中的美，可是真正能在人们脑海中留下记忆的东西却越来越少。人之所以会“熟视无睹”，这并不是人们体验美感的能力在下降，而是该事物对大脑的刺激性不够。给麻木的神经一点刺激，这种刺激不仅仅只是简单而短暂地停留在人的视网膜上，更应该在人们的内心世界中引起共震。
刺激性按性质的不同可以划分为：物理性刺激、化学性刺激、生物性刺激和社会心理性刺激。艺术作品中的刺激性主要是社会心理性刺激，如情绪激动、社会变革等，它是激发活动的因素或者行动的动因。艺术作品中的审美刺激性具备了一种给人以收益和乐趣的功效，它能给人以阵阵惊奇感，能引起思考，并能快速在人的脑子里留下一段持久的记忆。这种审美刺激性对我们这个数字图像等符号信息漫天飞舞的立体传媒时代的人来说是非常必要的。可以说从社会群体对艺术审美刺激性需求来讲，他们是非常渴望这种审美刺激性的。尤其是在现代都市化的社会中大多数人整天与高密度、高速度、高效率等彰显高压力的词汇打交道，再加上在许多的“被听”、“被看”等“被”状态下，对于敏感度越来越弱甚至产生了“抗体”的大众来说，审美刺激性也许是一味唤醒麻木神经的良方，能够为人们带来活力因子。无论是历史的传统的与当下的现代的艺术较量，还是东方的与西方的文化矛盾冲突，或是主流艺术与边缘艺术的话语权争夺，时时都在诱发刺激性与独特的审美体验，这种刺激不仅仅是视听觉上的，更是心灵与思想上的。当许多新的艺术形态作品呈现的时候，或许观者会感到茫然，对作品中的符号语言不能完全理解，或是感到一种莫名其妙与不知所云，甚至不少前卫作品需要借助于作者自己的大量解说才能让观众明白个中用意，但是我们当代的艺术受众群体却能拿出一种超常的耐心去仔细阅读或聆听以达到共通，这种对艺术的大度与包容是我们这个时代所特有的，大众对新的艺术作品中包含的审美刺激性的渴求亦是显而易见的，这对艺术自身的发展也是一件极大的好事。当然，艺术家们在进行艺术创作时对作品的形式与内容的择用要慎重，各种形态的艺术提供的审美刺激既要在审美感受形式上有强烈的刺激性，但又不乏平和之感；在审美感受内容上要让人们感觉熟悉、现实、严肃，又不乏陌生、神奇与愉悦。因此，超现实主义的那种怪诞与幽默最起作用。情理之中，意料之外的这种情境设计正是动画片《猫和老鼠》的惯用伎俩，各种角色在剧情、表情和动作上都不时地体现出一种打破常规的惯性与逻辑性思维。所以，无论是表述严肃的、还是愉悦神情的、还是调侃思辨的艺术作品，人们总会寄于期望，希望它能提供人们一个崭新的视角，一种异样的视听感受。
从艺术自身发展的角度来看，艺术无论是实现自身的发展与演变，还是一个创作时代的终结都伴随着一种艺术观念在情与理上的反叛，这种反叛伴有一种审美刺激性，并发挥着重要的作用。19世纪30年代摄影术的诞生挖掉了摹仿与再现艺术的墙脚，高超的绘画技艺不再是为人们顶礼膜拜的唯一对象，快速而高效的摄影技术使平民大众也能享受艺术之美；对“新之崇拜”的执着追求使现代主义艺术领域里掀起了一场 “占位运动”，现代艺术风格百花齐放，竞相实现对艺术的表现形式的超越，对表现题材的超越，以及实现艺术经典化与生活化的高度融合；当现代艺术貌似黔驴技穷之际，后现代艺术犹如一个顽童般悄悄到来，并以一种异常的混沌状态出场。混沌具备的内在随机性、非线性、对初始条件的敏感依赖性、非规则的有序性等特征，正好符合后现代艺术的状态特征，为艺术的探索提供了更多的可能。自后现代艺术之父杜尚用他的“小便池”为现成品在艺术作品中的大量运用谱写了艺术史的新篇章，大量新材料、新媒介在艺术领域里不断得以拓展，艺术进入了一个艺术媒材的新纪元。无论是老一辈还是新一代的年轻艺术家们都无时无刻不在努力探索新的艺术形式，丰富着人们的视觉体验，开拓着人们的审美领域，审美刺激性在后现代艺术时期再一次立下赫赫战功。打着混沌的旗号，艺术家们像是被禁锢已久的脱缰野马，进行着突破一切禁忌和界限的尝试。后现代艺术亦貌似一位患上了间歇性帕金森综合症的患者，有时高唱回归，体现出一种前所未有的艺术的使命感和责任感；有时表述无力，文化意韵萎缩；也有时会进行着歇斯底里的嚎叫，表现出一种愤世嫉俗。一种追求自由的精神在后现代艺术国度里弥漫着渗透着，审美刺激性在后现代艺术世界中大方异彩，以自己独有的方式吸引着人们的眼球，搅动着人们的视听，震撼着人们的心灵。近年来人们也不乏看到一些装置艺术、观念艺术、行为艺术、新媒体艺术等前卫艺术作品频繁登场，这些作品的表现形式日渐呈现跨媒体艺术趋势，给人们带来了全新的视听体验。
传统的艺术形式在坚守阵地的同时在不断地探索创新，当代的各种艺术形态也正在如火如荼地进行着实验、创新与发展，审美刺激性在艺术自身的演变与发展过程中发挥着重要的作用；艺术家们在他们的艺术之路上走的更深远更需要它起到酶化作用；而我们当下的社会大众更是渴望有它来刺激那业已麻木的末梢神经。在艺术的长河中已经有那么多具有历史性地位的艺术经典之作，折射出太阳般的耀眼光芒，当代的艺术家们也许需要做出更多的努力，在艺术的历史上增添辉煌的一笔。
[中图分类号] R365[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）10（a）-005-04
The effect of Astragalus and Safflower mixture on expression of tissue inhibitors of motalloprotenase in renal tubulointerstitial fibrosis in rats with Unilateral Ureteral Obstruction
DONG Hua-ling1,MA Ha2
(1.Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan030024,China;2.The Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)
[Abstract] Objective:To investigate the theraputic effects and its mechanisms of Astragalus and Safflower mixture in rats with Unilatreal Ureteral Obstruction.Methods:Rat renal interstitial fibrosis model was produced by unilateral ureteral obstruction,40 Wistar male rats were randomly divided into four groups:sham group(A group),UUO group(B group), A&S group(C group) and ACEI group(Dgroup). Sera and kidney tissues were collected from each group on the forteenth day.BUN and Scr were measured.It was carried out to measure the level of tubulointerstitial damage by Masson staining. The expression of TIMP-1 and fibronectin(FN) in kidneys was analyzed by immunohistochemical method. TIMP-1 mRNA was detected by in-situ hybridization method. Results:The expression of FN、TIMP-1、TIMP-1 mRNA and the renal interstitial fibrotic area were highter significantly than that in sham group. Compared with UUO group, those of the treatment groups decreased markedly. The level of BUN and Scr in UUO group were significantly highter than that in sham pared with UUO group ,the level of BUN and Scr in treatment groups were significantly lower.Conclusion:Astragalus and Safflower mixture can downregulate the level of BUN and Scr in UUO animal model rats, Astragalus and Safflower mixture can suppress the upregulation of TIMP-1 and FN expression in kidneys of UUO animal model rats and decrease their interstitial fibrotic area.It is inferred that it may be one of the mechanisms of Astragalus and Safflower mixture suppressing renal tubular damage and interstitial fibrosis.
[Key words] Unilateral ureteral obstruction;Renal tubulointerstitial fibrosis;Astragalus and safflower mixture;Tissue inhibitors of motalloprotenase.
肾间质纤维化(Renal tubulointerstitial fibrosis,RIF)是各种慢性肾脏疾病发展至终末期肾功能衰竭的主要病理基础[1]，尽管各种肾病的病因有所不同，但它们在向肾衰竭的发展过程中，都有着共同的途径即：肾小管萎缩、肾间质纤维化。
芪红合剂是在长期的临床实践中总结出的治疗肾脏疾病的经验方，在我们的前期研究中，芪红合剂对单侧输尿管结扎致肾间质纤维化大鼠模型肾组织的病变程度有一定改善，并可减少结缔组织生长因子（CTGF）的表达，本课题旨在研究芪红合剂对金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP-1）表达的影响，进一步探讨芪红合剂在肾间质纤维化中的作用及可能的作用机制，为临床用药提供可靠的理论和实验依据。
1材料和方法
1.1实验药物、试剂
1.1.1芪红合剂由黄芪、红花、大黄、水蛭等组成，按比例称取后由山西医科大学第二医院中药制剂室煎制，每毫升药液中含生药3.7 g。
1.1.2 依那普利佛山雅来制药有限公司提供，5 mg/粒
1.1.3 主要试剂基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1) 免疫组化试剂盒、原位杂交试剂盒纤维连接蛋白(FN) 免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司。
1.2实验方法
1.2.1 动物分组和造模雄性Wistar大鼠40只（由山西医科大学动物实验中心提供，二级），体重(150±3) g。常规饲养7 d后，随机分为4组：假手术组（A组）、手术模型组（B组）、芪红合剂组（C组）、依那普利组（D组），每组10只。采用单侧输尿管结扎致肾间质纤维化大鼠模型（UUO），模型制备方法参考文献[2]。术前3 d开始灌胃给药，假手术组、手术模型组正常进水进食，芪红合剂组每天给予芪红合剂2 ml/只，依那普利组按10 mg/kg给予依那普利每天1次。手术后第14天以10%水合氯醛0.03 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，从腹主动脉采血，分离血清，用于测定血生化指标；摘取左肾分别用10%中性甲醛和4%的多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，用于免疫组化分析和原位杂交分析。
1.2.2观察指标
1.2.2.1血生化指标的检测血尿素氮(BUN)采用二乙酰一肟法、血肌酐(Scr)采用苦味酸不除蛋白法测定。
1.2.2.2肾组织病理观察石蜡包埋切片行HE和Masson染色。光镜下观察肾小管及间质的结构及变化。Masson染色在400倍光镜下观察肾间质胶原纤维染色，每组选取8张切片，每张切片选取不重复的8个视野。采用BI2000医学图像分析系统进行半定量分析，计算肾间质Masson染色阳性面积及阳性面积占整个视野百分比。
1.2.2.3肾组织TIMP-1、FN免疫组织化学观察肾组织中TIMP-1、FN免疫组化采用SABC法，采用BI2000医学图像分析系统，在400倍光镜下测量每个显示屏的阳性染色面积和染色强度(平均光密度)。每组选取8张切片，每张切片测量8个视野进行半定量分析。
1.2.2.4肾组织TIMP-1原位杂交观察石蜡切片经常规脱蜡至水，30%H2O21份蒸馏水10份混合，灭活内源性酶；滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化5 min。用0.1 M PBS（pH7.2~7.6），室温固定10 min；加预杂交液，恒温箱38～42℃3 h；加杂交液，恒温箱38～42℃过夜； 37℃左右水温的2×SSC洗涤2次，每次5 min，37℃，0.5×SSC洗涤1次，15 min；滴加封闭液，37℃温箱内30 min；滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃温箱内放置70 min；滴加生物素化过氧化物酶，37℃温箱内放置20 min；显微镜下DAB显色。采用BI2000医学图像分析系统，在400倍光镜下测量每个显示屏的阳性染色面积和染色强度(平均光密度)。每组选取8张切片，每张切片测量8个视野进行半定量分析。
1.2.3统计学方法所有数据采用SPSS11.0软件处理，结果均以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两间比较采用SNK-q检验。
2结果
2.1肾功能检测结果
手术模型组尿素氮和血肌酐均较假手术组升高，两治疗组较手术模型组呈下降，提示中药芪红合剂及依那普利均能降低梗阻性实验大鼠血尿素氮、血肌酐水平。见表1。
2.2肾脏病理观察结果
肉眼观察可见：假手术组肾脏大小形态正常，颜色暗红，手术模型组结扎侧肾脏体积明显肿大，内含混浊尿液，颜色变浅，肾实质变薄，肾盂扩张。光镜下HE染色结果：假手术组肾脏组织结构正常，肾小管排列紧密、整齐；手术模型组可见肾小管排列紊乱，弥漫的肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性，多数肾小管扩张、部分萎缩，偶见坏死，肾间质增宽，肾小管间质中有炎症细胞浸润和间质纤维化，治疗组上述改变均较手术模型组减轻。Masson染色示：假手术组肾脏有胶原染色主要位于肾小球基膜、Bowman囊、系膜区和肾小管的毛细血管周围；模型组可见肾间质增宽，大量胶原纤维增生，间质胶原纤维呈蓝色染色，间质纤维化呈灶状分布，肾小球病变不明显，治疗组上述改变均有所减轻。见表2，图1，2。
2.3肾组织中TIMP-1的免疫组化分析
假手术组大鼠肾小管上皮细胞胞浆有少量TIMP-1表达，肾小球和肾间质细胞少见TIMP-1表达。手术模型组可见TIMP-1表达较假手术组明显增强，主要在皮髓交界的肾小管间质区以及肾小管上皮细胞表达明显。治疗组较手术模型组表达明显减弱，但仍未达到假手术组水平。见表3，图3。
2.4 FN的免疫组化分析
假手术组大鼠肾小球及肾小管基底膜呈弱阳性表达，肾间质无阳性表达，手术模型组表达明显增多，主要位于纤维化的肾间质中，围绕在萎缩的肾小管周围，肾小球及肾小管基底膜呈中度表达，两治疗组较手术模型组表达降低，但仍较假手术组明显。见表4，图4。
2.5肾组织中TIMP-1 mRNA表达的分析
原位杂交结果显示，TIMP-1 mRNA的表达与其蛋白表达部位大致相同，假手术组可见肾小管中有少量表达，在手术模型组肾小管中表达明显增强，治疗组较手术模型组表达明显降低，但仍高于假手术组。见表5，图5。
3讨论
肾间质纤维化是各种原因造成的肾小管及间质病变的最终结果，也是导致慢性肾衰竭的主要原因之一[3]，细胞外基质（ECM）的大量沉积是肾间质纤维化形成的主要机制[4]。现已证实ECM的降解减少是引起ECM积聚的主要原因[5]。
TIMP-1是基质金属蛋白酶抑制剂家族的重要成员，通过抑制MMPs的活性而阻断其对细胞外基质的降解作用，引起细胞外基质的积聚而导致脏器纤维化。在对不同时期肾脏病患者肾组织中TIMP-1/MMP-9表达的研究中发现[6]：肾小管间质中TIMP-1的表达随肾脏病患者肾间质纤维化程度的加重而逐渐增强，提示TIMP-1增高参与了肾间质纤维化的发生机制。在动物实验中亦有类似发现[7]：TIMP-1蛋白表达升高出现于UUO术后早期，且其表达量随着肾小管间质病变进展而增加，提示TIMP-1可能参与梗阻肾肾小管间质病变进展，而且可能是肾间质纤维化的早期促进因子。
肾间质纤维化在中医属于“水肿”、“癃闭”、“关格” 等疾病的范畴。结合现代医学微观发病机制，根据中医“久病多虚”、“久病入络”、“病久多瘀”的理论，我们认为本病属于中医气虚血瘀、痰瘀互结、蕴久化毒为害所致。在长期临床实践中，根据病症结合、整体调节的理论，对各种慢性肾脏疾病运用扶正活血化瘀通络之法，选用基础方芪红合剂进行辩证治疗，能够有效地改善患者的临床症状，延缓病情的进展，提高患者的生存质量。芪红合剂是以黄芪、红花、大黄、水蛭等为主组成，全方配伍可攻补兼施，攻邪而不伤正，扶正又不助邪，共奏益气活血化瘀通络之效。
研究中我们采用单侧输尿管结扎致肾间质纤维化模型，分别观察了金属蛋白酶组织抑制剂－1（TIMP－1）及纤维连接蛋白（FN）在肾组织中的变化。研究中我们发现中药芪红合剂和依那普利均可抑制TIMP-1在UUO大鼠肾组织中表达的上调。提示中药芪红合剂可能通过抑制TIMP-1在UUO大鼠肾组织中的表达，从而延缓肾小管损伤和肾间质纤维化的进展。肾间质纤维化是以ECM在肾间质的大量积聚为特征，FN是ECM的主要成分之一，与肾间质纤维化的关系密切，正常情况下，FN在肾脏表达不明显，在肾间质纤维化时表达明显增强[8]。在本实验中我们发现UUO大鼠肾组织中可见肾间质中有大量胶原纤维增生，纤维化的肾间质中FN的表达明显增强，中药芪红合剂和依那普利治疗组较UUO组有所降低，提示中药芪红合剂可抑制FN在肾间质中表达的上调，减少ECM的过度沉积，减轻肾间质纤维化的病变程度。
在前期的动物实验中，我们发现中药芪红合剂可下调UUO大鼠肾组织中CTGF的表达，对于中药芪红合剂对FN表达的影响是与其直接作用相关，还是通过抑制TIMP-1或某些致纤维化因子在UUO大鼠肾组织中表达的上调而产生的间接作用，或是二者协同作用的结果，尚有待进一步研究。
在本研究中我们发现中药芪红合剂与依那普利均可通过下调UUO术后大鼠的血肌酐和尿素氮水平，明显改善其肾功能，并可通过下调TIMP-1在肾组织中的表达减轻肾小管损伤和间质纤维化，提示抑制TIMP-1的表达上调是中药芪红合剂抗肾小管间质损伤的作用机制之一。
[参考文献]
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[6]汤，袁发焕.金属蛋白酶组织抑制因子-1基质金属蛋白酶-9的表达与肾脏纤维化的关系[J].中国现代医学杂志，2002，12（2）：13-15.
[7]董健平，陈香美，师锁柱,等.金属蛋白酶组织抑制剂1在大鼠肾小管间质损害中的表达及其意义[J].中华肾脏病杂志，2002，18（4）：275-279.
【关键词】 丹参酮； D-半乳糖 β-淀粉样肽蛋白 诱导型一氧化氮合酶 乙酰胆碱酯酶 大鼠
Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of tanshinone on levels of iNOS and AChE in hippocampus of dementia model rats induced by D-galactose combination with Aβ1-40.Methods①The experimental animals were randomly pided into three groups. In AD model group 1.25%D-galactose in combination with microinjection of 10 μg incubated amyloid β-peptide 1-40 (Aβ1-40) into the dorsal blade of the dentale gyrus in the hippocampus of rat. In tanshinone therapeutic group，after establishment of rat AD model for 24 h ， tanshinone〔50 mg/(kg·d)〕was given for 14 days by gastric perfusion. In solvent control group，the rats were treated with the same method as AD rats but received injection of the same physiological saline. ② The expression of iNOS and AChE in rat hippocampus were respectively observed by immunohistochemical and histochemical methods .Results ①AChE positive nervous fibers， optical density of AChE positive nervous fibers of AD rats in the hippocampus were decreased.iNOS-ir cells count and the average optical density of AD rats in the hippocampus were significantly increased as compared with solvent control group. ②After tanshinone treatment， iNOS -ir cell count and the optical density were obviously decreased， optical density of AChE-positive nervous fibers were significantly increased as compared with AD model group.ConclusionMechanism of tanshinone to improve learning and memory impairment in dementia model rats induced by D-galactose in combination with Aβ1-40 might be related to protection of cholinergic nerves in brain and decrease of iNOS expression in hippocampus .
Key words：Tanshinone; D-galactose; β-amyloid peptide protein (Aβ); Inducible nitric oxide synthase（iNOS）； Acetylcholinesterase（AChE） ; Rats
老人常见的痴呆病因是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease， AD）［1］，而AD的病因、发病机制尚未完全清楚。AD患者大脑内主要变化的神经递质是乙酰胆碱（acetylcholine ，ACh），一氧化氮（nitric oxide， NO）及诱导型一氧化氮合酶（inductive nitric oxide synthase， iNOS）［2～4］ 。有报道，丹参酮ⅡA和ⅡB能减少小鼠短暂的（急性）局灶性脑缺血的脑梗死灶体积，并可能有神经保护作用［5］，还能改善缺血再灌注损伤小鼠和东莨菪碱（抗胆碱药）诱发的空间行为缺陷小鼠的学习、记忆障碍［6］。但就丹参酮对D-半乳糖- Aβ1-40诱发复合痴呆（记忆障碍）病变大鼠的作用未见报道。因此，本研究采用腹腔注射1.25%D-半乳糖致衰老加双侧海马微量注射凝聚态Aβ1-40诱发AD样复合痴呆（记忆障碍）大鼠模型，以观察海马内ACh的降解酶乙酰胆碱酯酶（acetyl cholinesterase， AChE）和iNOS表达的变化，同时观察丹参酮改善大鼠学习记忆的神经化学机制。
1 材料
1.1 动物选用清洁二级spraque-Dawley(SD)雄性大鼠共45只，体质量250 g左右（华中科技大学同济医学院实验动物学部提供）。实验动物随机分成3组：①AD模型组15只;②丹参酮治疗组20只；③溶媒对照组10只。
1.2 试剂及仪器丹参酮（华中科技大学同济医学院临床药理学教研室惠赠），Aβ1-40、DAB（Sigma公司，美国），iNOS多克隆兔抗鼠抗体（Santa Cruz公司），生物素标记羊抗兔IgG工作液、辣根酶标记链霉卵白素（S-A/HRP）工作液（北京中山生物有限公司）。江湾Ⅰ型脑立体定位仪（上海川沙花木农机厂），Y-型水迷宫（中国医学科学院药物所研制），AO恒冷箱切片机（美国AO公司），HPIAS-1000彩色病理图文分析系统（华中科技大学同济医学院清屏影像工程公司组装）。
2 方法
2.1 造模方法全部大鼠在实验前应用水迷宫试验进行学习记忆功能的检测，选取学习记忆功能正常的大鼠随机配组实验；每组动物造模完成后，分别采用水迷宫试验鉴定动物模型。
2.1.1 动物学习记忆功能的测试采用Y-型水迷宫试验监测大鼠学习记忆功能。记录大鼠平均逃避潜伏期（从入水起点至寻找到阶梯出水的时间）和进入盲端的错误次数（逃避错误频率，次/3min）。预训练4 d，2次/d，每次训练时间定为3 min，3 min仍未找到安全通道者以180s计算。训练第1天让大鼠自由游泳，第2～4天训练时，试验者可引导大鼠进入安全通道。
按照Zealonga 5级评分法，在造模大鼠清醒后，立即进行动物神经功能的评定。评分标准为：正常（0分）；对侧肢体屈曲（1分）；拖鼠尾后拉时，对侧肢体无力（2分）；拖鼠尾后拉时，向对侧转圈（3分）；自发向对侧转圈或倾倒（4分）。选取评分为2分及以上造模大鼠入围实验。
2.1.2 D-半乳糖腹腔注射参照文献［7，8］以无菌生理盐水配制1.25% D-半乳糖溶液。AD模型组和丹参酮治疗组按50 mg·kg-1·d-1的标准计算相应的D-半乳糖盐液量，腹腔注射，连续6 周。溶媒对照组大鼠与AD模型组同法腹腔注射等量的生理盐水。
2.1.3 Aβ1-40海马注射在D-半乳糖连续处理6周后的第2天，施行Aβ1-40海马注射。即：大鼠腹腔注射10 %水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉，头顶部去毛，消毒皮肤并切开1.5 cm长切口，暴露颅骨和前囱。用牙科钻头钻开颅骨，在海马齿状回背侧（参照大鼠脑立体定位图谱，定位坐标为前囟后3.5 mm，脑正中线旁开2.0 mm，深度2.7 mm）缓慢注入Aβ1-40各1 μl（10 μg Aβ1-40溶于1 μl无菌生理盐水，用前37℃下孵育1周，使其凝聚老化）。注射完毕后留针5 min（保证溶液充分扩散），然后缓慢起针。蜡封闭针孔，撒消炎粉止血消炎，缝合皮肤。溶媒对照组大鼠与AD模型组同法，于海马区注射等量的生理盐水1 μl。术后将大鼠放回鼠笼中常规饲养。并肌注青霉素抗感染（40万u/d·只，连续7 d）。丹参酮治疗组在D-半乳糖-Aβ1-40复合造模后24 h给予丹参酮［9］，丹参酮均按50 mg·kg-1·d-1溶于5 ml玉米油中灌胃。溶媒对照组及AD模型组仅以等量玉米油灌胃。各连续14 d。
2.2 染色方法实验大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，经左心室升主动脉灌注温的生理盐水100 ml，随即快注冷的4%多聚甲醛固定液（4℃，pH7.3）100 ml，然后慢速灌注多聚甲醛液250 ml。开颅取脑，依次入20%、30%蔗糖磷酸缓冲液（PB，0.1 mol/L，pH7.4）中浸透，制作海马冠状恒冷箱连续切片，片厚25 μm，PB接片，收集全部切片，做形态学各项指标检测。
2.2.1 AChE组织化学法部分切片入改良的karnovsky-Roots孵育液，37℃孵育2h，以0.05 mol/L Tris-HCI缓冲液（pH7.6）漂洗切片，DAB/H2O2-硫酸镍铵染色液显色。阳性神经纤维呈灰蓝色。
2.2.2 iNOS免疫活性的表达（SP法）部分切片用0.25%triton X-100，37℃预处理30 min。转入正常小牛血清室温20 min（封闭非特异抗原）。切片先后入一抗（iNOS，1∶100）4℃孵育72 h，二抗室温30 min，SP复合物（S-A/HRP）反应30 min，DAB/H2O2-硫酸镍铵液显色。阴性对照以PBS替换一级抗体。
2.3 统计方法每只实验大鼠随机选5张切片，10×20光镜视野下标定海马切片CA1和CA4区。利用HPIAS-1000彩色图像分析系统分别测定海马各亚区的面积（S）和AChE阳性神经纤维的面积（S’）（阳性面积百分比：S’/S）。以及iNOS-Ir神经元计数和平均光密度测定。所有的数据以±s表示，采用SPSS12.0 统计软件进行单因素方差分析和多组间均数比较，以P＜0.05为差异有显著性意义。
3 结果
经水迷宫试验，证明本研究全部入围实验大鼠造模前学习记忆功能均正常。AD模型组大鼠出现2～3分级神经功能障碍，但无瘫痪或死亡动物。同时，发生严重的学习记忆功能障碍；经丹参酮治疗后大鼠学习记忆功能显著改善（限于篇幅详细测定结果资料略）。
3.1 丹参酮对海马内iNOS-ir细胞表达的影响溶媒对照组海马CA4及CA1区，有少量iNOS-ir细胞表达。AD模型组海马内明显可见局部神经元受损(CA4)，其周边出现大量增生的iNOS-ir细胞，其形态多样，类似于胶质细胞，突起明显，胞体及突起均有iNOS-ir着色。CA1区有可见少量此类细胞。丹参酮治疗组海马内各区iNOS-ir细胞的表达明显低于模型组（结果见表1）。表1 丹参酮对D-半乳糖-Aβ1-40处理大鼠后海马内iNOS表达的影响（略）
3.2 丹参酮对海马内ACh能神经的影响溶媒对照组海马CA1及CA4区（层）富含AChE阳性纤维末梢细密网，膨体丰富。CA1及CA4以多形细胞层、辐射层和分子层丰富，锥体细胞层最少。在CA4分子层AChE阳性纤维较密集，颗粒细胞和多形细胞层则较少。各区可见少量的AChE弱阳性反应细胞。AD模型组CA1及CA4区AChE阳性纤维着色浅，膨体少，纤维网稀疏。注射区深部出现AChE阳性纤维受损迹像。丹参酮治疗组部分模型组给予丹参酮处理后，海马内各区AChE阳性纤维的着色及密度界于上二组之间，即受损程度明显减轻。
图像分析测定海马CA4、CA1区AChE阳性纤维密度及所占面积，经统计学分析。结果见表2。表2 丹参酮对D-半乳糖-Aβ1-40处理大鼠后海马内AChE表达的影响（略）
4 讨论
4.1 痴呆动物模型的评价AD主要行为改变为记忆能力下降和认知功能障碍，主要病理改变有老年斑和神经原纤维缠结［1］。因此，建立模拟AD行为改变和病理特征的痴呆动物模型，对于AD治疗药物筛选，发病机制的研究有重要意义。本研究动物模型采用复合AD动物模型。即：在腹腔注射D-半乳糖致衰老的基础上于大鼠海马内微量注射Aβ1-40模拟复制AD痴呆动物模型。具有以下特点：①与人类AD发病机制有相似性，能仿真出AD的行为学改变；②能模拟复制出AD的主要病理改变；③与临床病症相仿；④技术稳定可复制。通过水迷宫试验评价，证明D-半乳糖与Aβ1-40复合诱发大鼠AD模型较D-半乳糖［8］或Aβ单一造模［9］优越。该模型更适用于AD样老年痴呆发病机制及治疗药物筛选的研究。
4.2 中枢胆碱能神经与AD中枢胆碱能神经系统通过边缘系统和大脑皮层调节学习和记忆过程。在边缘系统中隔区内侧核和斜角带核发出的胆碱能神经纤维，经穹窿投射到海马，这条胆碱能通路与学习记忆密切相关，切断海马-穹窿投射神经纤维，可导致学习记忆障碍。
AD患者大脑内主要变化的神经递质是乙酰胆碱，在皮层、尾核中ChAC、AChE活性显著降低，同时主要发出胆碱能神经纤维向皮层投射的基底神经节的神经元也受损，ACh释放减少。本研究，D-半乳糖-Aβ1-40复合造模后，海马内各亚区AChE阳性神经纤维也明显减少，提示Aβ可以损害胆碱能神经元。治疗组大鼠用丹参酮（50 mg·kg-1·d-1）处理后，海马内Aβ的表达明显减少，而AChE酶活性增加，表明丹参酮能提高记忆功能的机制，可能是通过降低Aβ的表达，保护海马胆碱能神经免遭损害来实现的。
4.3 iNOS与ADAD患者脑内iNOS-ir神经元明显增多，局部可见大量神经元受损，与Aβ的过度沉积直接相关，提示iNOS可能与AD有关［10］。
NO是与学习记忆有关的逆行信息分子，参与海马长时程增强（LTP）的形成。但是，高浓度的NO则有神经毒作用。AD患者脑内Aβ异常增多，Aβ通过激活小胶质细胞和星形胶质细胞从而引起iNOS介导的NO大量产生而杀伤脑内神经元［11］。
本研究表明，D-半乳糖与Aβ1-40复合造模后，海马各亚区iNOS-ir神经元表达明显增高，同时局部神经元大量受损。丹参酮干预治疗组大鼠则可减少iNOS的表达，和减轻脑内局部神经元的受损。由此提示，丹参酮改善大鼠学习记忆的作用机制，其中还有是通过抑制海马内iNOS的表达，而保护脑局部神经元免遭损害来实现的。
参考文献
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